東北細毛羊胎羊卵巢卵泡發(fā)育及體外培養(yǎng)研究.pdf

1、羊的產(chǎn)仔性能介于單胎動物和多胎動物之間，其卵巢卵泡發(fā)育的研究有助于從理論上對動物生殖生理進一步認(rèn)識，也為提高動物的繁殖力奠定理論基礎(chǔ)。充分了解羊卵泡發(fā)生和卵母細胞成熟，對合理改進超排技術(shù)和充分利用卵巢卵母細胞資源具有重要意義。 在動物轉(zhuǎn)基因等研究中，可供分子水平進行操作的雌性生殖系細胞除了有受精卵、早期胚胎及胚胎干細胞之外，胚胎期生殖細胞也是一類可供分子水平操作的細胞，目前已經(jīng)越來越受到人們的重視。如外源DNA導(dǎo)入的生殖細胞，如

2、果能夠利用導(dǎo)入外源基因的胚胎期卵巢生殖細胞與卵巢體細胞重新構(gòu)建形成卵泡/卵巢，經(jīng)過卵巢移植，直接使受體動物排出帶有外源基因的卵母細胞，將為轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)提供新的方法。另外，卵泡體外重組和卵巢移植也可為臨床治療卵巢疾病提供新的思路。所以，目前對胚胎期卵巢發(fā)育的研究已經(jīng)愈顯重要。 哺乳動物卵巢內(nèi)的原始卵泡庫是雌性生殖資源的儲存庫，反芻動物(牛、羊)在胎兒時期形成并發(fā)育，但大部分卵泡在腔前階段退化閉鎖了，這無疑是對這一資源的巨大浪費

3、，隨著生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，對可利用卵母細胞的需求日益增加，單純依靠超排技術(shù)或卵母細胞體外成熟技術(shù)已不能滿足日益增長的商業(yè)和研究目的的需要，因此有越來越多的學(xué)者致力于腔前卵泡的研究，并在了解了腔前卵泡的結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，建立了一系列腔前卵泡培養(yǎng)體系。但以上這些研究大多是以出生后、特別是性成熟的動物作為實驗材料。胎兒期較系統(tǒng)的研究未見報道。 本實驗以東北細毛羊胎羊卵巢為研究材料，對不同胎齡的東北細毛羊胎羊卵巢卵泡發(fā)育的組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和

4、酶細胞化學(xué)進行了系統(tǒng)地研究，了解和掌握了胎羊卵泡和卵母細胞的發(fā)育規(guī)律；進而，建立了一套有效的胎羊卵巢腔前卵泡的采集方法，并對發(fā)育不同階段的卵泡及卵母細胞進行了體外培養(yǎng)的初步探索，為充分利用腔前卵泡資源奠定了理論和實踐基礎(chǔ)。 實驗結(jié)果表明： 1.胚胎卵巢重量與胚胎長度、胚胎重量、卵巢體積擬合的回歸方程：Y4=6.357+0.088Y1+0.004Y2+13.707Y3其中Y1為胚胎長度(cm)；Y2為胚胎重量(g)；Y3為

5、卵巢體積(ml)Y4為卵巢重量(mg)。 2.東北細毛羊胎羊卵巢髓質(zhì)組織結(jié)締化程度逐漸增大，血管不斷增多、變粗和向四周擴展，至20周時，已占據(jù)卵巢中央的大部分區(qū)域，把皮質(zhì)推壓到較窄的邊緣區(qū)域。胎羊卵巢10周齡左右髓質(zhì)與皮質(zhì)分界模糊，到12周齡左右分界明顯，21周齡左右形成了完整的皮質(zhì)和髓質(zhì)。 3.隨著胎羊的生長發(fā)育，卵原細胞在逐漸減少，而卵母細胞在不段地增加。到21周齡左右基本完成了卵母細胞的儲備。 4.胎羊卵巢

6、10周齡左右出現(xiàn)原始卵泡；12周齡左右出現(xiàn)由原始卵泡向初級卵泡過渡的中間類型；14周齡左右規(guī)則的單層立方卵泡細胞的初級卵泡出現(xiàn)；18周齡發(fā)現(xiàn)了次級卵泡。 5.18周齡左右胎羊卵巢卵泡卵母細胞出現(xiàn)透明帶；20周齡左右胎羊卵巢卵母細胞被3～4層顆粒細胞包圍時，形成了一薄層較完整的透明帶。20周齡左右胎羊卵巢卵泡卵母細胞出現(xiàn)了三級卵泡，21周齡左右發(fā)現(xiàn)大腔卵泡(葛拉夫氏卵泡)。 6.卵泡窩存在于胎羊卵巢發(fā)育的整個過程中，以三種

7、形式存在：即多卵原細胞構(gòu)成的卵泡窩、多卵母細胞構(gòu)成的卵泡窩及多卵原細胞和多卵母細胞共同構(gòu)成的卵泡窩。 7.在胎羊卵巢中，發(fā)育早期存在由許多卵原細胞構(gòu)成的復(fù)合體；多卵原細胞或多卵母細胞或二者共同構(gòu)成的小復(fù)合體，存在于胎羊卵巢發(fā)育整個過程中。 8.胎羊卵巢原始卵泡的形成過程 一種形式：卵原細胞分裂成初級卵母細胞后，外周被來自卵巢基質(zhì)的細胞包圍，即形成單卵初級卵泡細胞的卵泡；另一種形式：首先卵原細胞不斷、快速地有絲分裂

8、，被多層梭形細胞完整包圍，形成大的卵原細胞復(fù)合體，然后，又分裂成許多小的復(fù)合體，最后，卵原細胞分裂為初級卵母細胞(1個或數(shù)個)，卵泡細胞侵入，形成原始卵泡。 9.胎羊卵巢在卵巢發(fā)育各階段都有一定數(shù)量卵母細胞發(fā)生退行性變化—閉鎖。 10.胎羊卵巢卵泡卵母細胞堿性磷酸酶，主要定位在卵母細胞質(zhì)膜上。胚胎早期，核的代謝活動強烈，隨著胎兒生長，代謝活動減弱，而細胞膜的代謝活動恰好相反。 11.酸性磷酸酶，主要定位于溶酶體上

9、。隨著胎兒的發(fā)育，胎羊卵巢卵泡卵母細胞上酸性磷酸酶不斷增多，即卵母細胞退化逐漸增加。 12.用機械-酶消化法分離不同發(fā)育階段的胎羊卵巢腔前卵泡最適宜的膠原酶濃度是0.06％(w/v)(含膠原酶約120消化單位/mL)。分離12周齡左右的胎羊腔前卵泡所獲得的原始卵泡數(shù)量比其它時期分離的要多，分離獲得初級卵泡的最佳時間是在20周齡左右。隨著胎齡增加，分離所得正常卵泡率逐漸增加。 13.在本培養(yǎng)體系中，0.6IU/mlPMSG

10、處理組對胎羊腔前卵泡體外48h培養(yǎng)效果最好。在培養(yǎng)的過程中，腔前卵泡活率隨培養(yǎng)時間延長而逐漸下降。20、21周齡左右胎羊卵巢腔前卵泡體外培養(yǎng)72h，體積明顯大于其它培養(yǎng)各組，腔前卵泡培養(yǎng)活率也顯著高于其它培養(yǎng)各組，21周齡左右胎羊腔前卵泡活率可達38.98％。 14.胎羊腔前卵泡體外培養(yǎng)，原始卵泡可以發(fā)育到初級卵泡；初級卵泡多數(shù)能發(fā)育到次級卵泡階段，少數(shù)能發(fā)育到有腔卵泡初期的體積；次級卵泡部分能發(fā)育到早期腔卵泡體積，絕少數(shù)出現(xiàn)了