分離的大鼠卵泡冷凍保存和移植的初步研究.pdf

1、許多患有腫瘤、血液疾病或自身免疫性疾病的女性患者因?yàn)獒t(yī)學(xué)水平的提高而獲得到治愈，但其卵巢功能由于物理或化學(xué)治療而遭到了嚴(yán)重?fù)p害或衰竭。因此，卵巢功能的保護(hù)受到越來越多的重視，目前保存女性生殖能力的方法有以下幾種：使用一些相應(yīng)的藥物來保護(hù)卵巢、冷凍保存胚胎、冷凍保存卵子、卵巢組織的冷凍保存與移植等。卵巢組織的冷凍保存是一種有潛力的方法，因?yàn)槠渲泻写罅康氖芾鋬鲇绊懶〉氖蓟雅?。但是，近來很多研究表明卵巢組織的移植會(huì)引起腫瘤的復(fù)發(fā)，特別是血

2、液系統(tǒng)引起的惡性腫瘤。而從卵巢組織分離得到的卵泡的冷凍保存與移植似乎是一種很好的避免惡性腫瘤傳播的方法。Oktay等首次報(bào)道了使用膠原酶從人卵巢組織中成功地分離得到了始基卵泡。這種方法可以得到質(zhì)量好的卵泡，這是分離卵泡培養(yǎng)和移植的必要條件。
　　 目前的冷凍方法主要包括慢速冷凍和玻璃化冷凍等。慢速冷凍因?yàn)椴荒鼙苊獗У男纬?，所以限制了其?yīng)用。而玻璃化冷凍是一種快速冷凍方法。其降溫、復(fù)溫速度都很快，在極短時(shí)間內(nèi)無法形成冰晶，而是直

3、接地形成“玻璃樣”的固態(tài)，始終保持了細(xì)胞內(nèi)外的水分子和離子的分布，在某種程度上可以避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，使溶質(zhì)損傷減輕。固相表面玻璃化冷凍法是近來出現(xiàn)的一種新的玻璃化冷凍方法。該方法是把需要冷凍的細(xì)胞和組織放置在較高濃度的冷凍保護(hù)劑中平衡一段時(shí)間，然后直接放置于預(yù)冷至-150℃到-180℃的固相表面，以達(dá)到快速降溫。卵巢組織移植可以作為保存卵巢功能的一種方法，但是不可避免地會(huì)造成腫瘤復(fù)發(fā)。為了避免腫瘤復(fù)發(fā)，移植分離卵泡可能是一種好的選

4、擇。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：不同的冷凍方案對(duì)分離的大鼠卵泡冷凍保存的研究。
　　 目的：探索固相表面玻璃化冷凍方法與以往的慢速冷凍方法、開放式拉長麥管玻璃化冷凍方法相比，哪一種方法更適合于分離卵泡的冷凍保存。
　　 方法：⑴卵巢組織取自清潔級(jí)雌性Spragne-Dawley(SD)大鼠，鼠齡3周。⑵使用濃度為0.04 mg/mL Liberase Blendzyme3分離卵泡。⑶將卵泡放入不同的冷凍

5、液中浸泡后，吸入麥管中，再把麥管放入程序性冷凍儀上，緩慢降溫，最后放入液氮中保存。復(fù)溫時(shí)，將卵泡依次放入不同的解凍液中，置換出冷凍保護(hù)劑。⑷將卵泡放入不同的冷凍液中浸泡后，吸入開放式麥管中，然后直接把麥管放入液氮中冷凍保存。復(fù)溫時(shí)，將卵泡依次放入不同的解凍液中，置換出冷凍保護(hù)劑。⑸將卵泡放入不同的冷凍液中浸泡后，直接將含有卵泡的液體滴在用液氮預(yù)冷后的固相表面，使之成為小球，然后把小球移入冷凍管中，放入液氮中保存。復(fù)溫時(shí)，將卵泡依次放入不

6、同的解凍液中，置換出冷凍保護(hù)劑。⑹將卵泡放入濃度為2μM Calcein AM和5μM Ethidium homodierⅠ微滴中，然后置于37℃的培養(yǎng)箱中30 min，用DPBS洗滌之后在熒光顯微鏡下觀察。⑺從分離的新鮮卵泡和凍融后的卵泡中隨機(jī)選擇卵泡，經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后行電鏡檢查。⑻把卵泡移入含有1.5％藻酸鈉溶液中，用移液器吸出10μL的液體，然后滴入0.25 M的CaCl2中，立即形成一個(gè)微球，把得到的微球移入5孔培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中

7、培養(yǎng)72小時(shí)。分析卵泡直徑的變化并測(cè)量培養(yǎng)液中的雌激素水平。
　　 結(jié)果：①本實(shí)驗(yàn)中對(duì)876個(gè)卵泡進(jìn)行了活性分析，在SSV組，完全有活性卵泡的比例為64.76％，高于OPS組(62.38％)，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而SSV組中完全有活性卵泡的比例顯著高于慢速冷凍組(52.65％)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。②本實(shí)驗(yàn)中對(duì)于65個(gè)新鮮卵泡和凍融卵泡進(jìn)行了電鏡下超微結(jié)構(gòu)的分析。12個(gè)新鮮卵泡中僅有1個(gè)卵泡的線粒體出現(xiàn)腫脹。而

8、經(jīng)過不同冷凍方法凍融后的卵泡則出現(xiàn)了不同的損傷。在各種損傷中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷(SSV組、OPS組和慢速冷凍組中的比例分別是：60.0％，50.0％和75.0％)和線粒體的損傷(SSV組、OPS組和慢速冷凍組中的比例分別是：40.0％，50.0％和50.0％)最常見。SSV組中，微絨毛損傷、線粒體損傷和核膜損傷的比例與OPS組的和慢速冷凍組的相比有減少的趨勢(shì)，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③本實(shí)驗(yàn)中共對(duì)200個(gè)卵泡進(jìn)行了體外三維培養(yǎng)。新鮮卵泡的體外

9、培養(yǎng)發(fā)育能力是最好的，直徑增長平均為36.60±2.98μm。而慢速冷凍組的卵泡體外培養(yǎng)發(fā)育能力最差，直徑增長平均為20.10±2.18μm。SSV組的卵泡直徑增長為28.90±2.21μm，顯著高于慢速冷凍組的，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。SSV組的雌激素水平明顯高于OPS組的和慢速冷凍組的，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。
　　 結(jié)論：固相表面玻璃化冷凍法(SSV)與以往傳統(tǒng)的慢速冷凍法、拉長式開放麥管玻璃化冷凍法相

10、比，是一種更方便、更有效、適合冷凍保存分離后的大鼠卵泡的方法。
　　 第二部分：分離的大鼠卵泡異種移植到NOD-SCID小鼠的研究。
　　 目的：對(duì)凍融后的分離卵泡以藻酸鈉為載體建立異種移植的動(dòng)物模型，觀察卵泡的生長發(fā)育情況和血管生成情況，并與傳統(tǒng)的卵巢皮質(zhì)片移植作比較，希望找到更適合卵泡生長的移植模式。
　　 方法：⑴卵巢組織取自清潔級(jí)雌性Spragne-Dawley(SD)大鼠，鼠齡3周。移植用小鼠為NOD-

11、SCID小鼠。⑵使用濃度為0.04 mg/mL Liberase Blendzyme3分離卵泡。⑶將卵泡或者卵巢皮質(zhì)片以不同的冷凍保護(hù)劑溶液浸泡后，直接將含有卵泡或者皮質(zhì)片的液體滴在用液氮預(yù)冷過的固相表面，使之成為小球，然后把小球移入冷凍管中，放入液氮中保存。復(fù)溫時(shí)，將卵泡或者皮質(zhì)片依次放入不同的解凍液中，置換出冷凍保護(hù)劑。⑷以藻酸鈉為載體，把分離的卵泡移植到小鼠一側(cè)的腎脂肪囊下。另一側(cè)腎脂肪囊下移植取自同一只大鼠的卵巢皮質(zhì)片。⑸回收的

12、移植物經(jīng)HE染色后，在光鏡下分析計(jì)數(shù)卵泡。⑹用CD31分析移植物微血管生成情況，用Ki-67分析卵泡的增殖性。
　　 結(jié)果：①移植后第3、5、7、14、28天回收到的移植物中卵泡數(shù)量分別為：5、5、51、1、3個(gè)。按移植的時(shí)間分析，移植效率分別為：3.68％、2.91％、25.24％、0.69％、2.10％。②移植后第3、5、7、14、28天回收到的移植物中卵泡數(shù)量分別為：1760、1575、1860、1830、640。移植后各