人和兔卵巢組織玻璃化冷凍保存及移植的實驗研究.pdf

1、卵巢組織冷凍及移植技術(shù)的發(fā)展，可提高各種原因?qū)е碌穆殉补δ軉适Щ颊叩纳钯|(zhì)量，并為免除激素替代治療所致的諸多不良反應和后果提供了新的思路。借助于卵巢組織冷凍、移植技術(shù)，達到糾正患病女性內(nèi)分泌失調(diào)以及保存其生育功能的目的。玻璃化冷凍方法(vitrification-freezing，VF)作為一種簡便、經(jīng)濟、有效的凍存技術(shù)，在輔助生殖領域主要應用于卵子和胚胎的保存，而在卵巢組織凍存方面的研究報道相對較少。與凍存卵子或胚胎相比，冷凍卵巢組織

2、因其能獲得更多的卵泡等諸多優(yōu)勢，從而對保存女性生育能力更具有優(yōu)勢。
　　 目的：
　　 本實驗通過觀察兔（人）卵巢組織冷凍前、后的組織形態(tài)學變化，觀察新鮮/冷凍卵巢組織分組異體異位移植至裸鼠體內(nèi)后的生長成活以及內(nèi)分泌功能的恢復情況，尋找卵巢組織玻璃化冷凍的適宜條件及移植部位，為臨床上開展人類卵巢組織玻璃化冷凍及移植，建立人類冷凍卵巢組織庫提供理論基礎。
　　 材料與方法：
　　 1材料
　　 卵巢

3、組織分別采自兔及人，裸鼠為卵巢組織移植宿主。
　　 1.1兔卵巢組織的獲?。?br>　　 取自4～5月齡的健康性成熟雌性日本大耳白兔。經(jīng)兔耳緣靜脈注射2％戊巴比妥鈉溶液(按2ml/kg)，麻醉后，行下腹正中切口，取出雙側(cè)卵巢組織。室溫下采用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered salin，PBS)漂滌多次，去除髓質(zhì)及血漬，并將卵巢組織切成約2*2*1mm3大小，等待冷凍或移植。
　　 1.2人卵巢組織的獲

4、取：
　　 2009年10月至2010年3月間，于鄭州大學第三附屬醫(yī)院募集11例因卵巢囊腫需要手術(shù)的患者，年齡為24～38歲。腹腔鏡下卵巢組織囊腫剝離術(shù)后，剪下附于囊腫壁上無明顯血栓的卵巢組織片。將獲取的人卵巢皮質(zhì)片置于裝有轉(zhuǎn)運液的無菌管內(nèi)，冰桶中保存，30min內(nèi)送至實驗室，在磷酸鹽緩沖液中反復漂滌、去除髓質(zhì)及血漬。將卵巢皮質(zhì)片切成2*2*1mm3大小的組織塊，等待冷凍或移植。
　　 1.3移植宿主-裸鼠
　　

5、 按是否進行卵巢組織移植及移植物的不同，將裸鼠分為4組，其中后三組均進行卵巢切除去勢：Ⅰ組（正常對照組）、Ⅱ組（新鮮組織移植組）、Ⅲ組（凍融組織移植組）、Ⅳ組（去勢組），觀察裸鼠動情周期恢復情況并行組織形態(tài)學檢查。
　　 2方法
　　 2.1卵巢組織玻璃化冷凍保存與復蘇
　　 冷凍：聯(lián)合采用低濃度比二甲基亞砜(dimethyl Sulphoxide，DMSO)和乙二醇(ethylene glycol，EG)作為玻

6、璃化液。分別將部分兔（人）卵巢組織塊在平衡液和玻璃化冷凍液中暴露一定時間，采用堅硬表面玻璃化法(solid-surface vitrification，SSV)冷凍后，將卵巢組織塊投入液氮中進行冷凍保存。
　　 復蘇：采取三步復蘇法將凍存的卵巢組織顆粒逐個復蘇。
　　 2.2卵巢組織異體異位移植
　　 隨機選取部分兔（人）新鮮及凍融復蘇后的卵巢組織塊，將其分別多點無血管移植到去勢裸鼠的左側(cè)頸部皮下。
　　

7、 2.3裸鼠雌激素水平、子宮形態(tài)變化及移植物組織學檢查
　　 對Ⅰ組（正常對照組）、Ⅱ組（新鮮組織移植組）、Ⅲ組（凍融組織移植組）裸鼠分別進行陰道細胞學涂片檢查，并采集裸鼠動情期血樣，測定其血清雌激素(estradiol，E2)水平，以此判定移植卵巢組織的功能狀況；Ⅳ組（去勢組）裸鼠于處死前采血，測定雌激素水平。采用化學發(fā)光法測定裸鼠血清雌二醇水平，判斷移植后新鮮及凍融的卵巢組織活性。
　　 于移植后35天左右，回收移植

8、物，行組織學檢查。將所有裸鼠的子宮完整切除，修剪子宮周圍系膜及多余脂肪，切下部分子宮組織，放置于甲醛溶液中固定，行石蠟包埋及HE染色。肉眼及光鏡下觀察裸鼠子宮形態(tài)學變化。
　　 3統(tǒng)計學處理
　　 采用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。裸鼠的動情周期恢復率采用四格表x2檢驗分析；各組間動情周期恢復時間采用成組t檢驗分析；動情周期天數(shù)及移植組織激素的測定均采用方差分析，結(jié)果用均值±標準差(x±s)表示，以α=0.05為

9、檢驗水準。
　　 結(jié)果：
　　 1．玻璃化冷凍后，卵巢組織內(nèi)以始基卵泡為主，并存在形態(tài)異常的卵泡。
　　 2．移植于裸鼠頸部皮下的新鮮及凍融兔卵巢組織均可觀察到存活組織塊。
　　 3．移植后存活的兔卵巢組織內(nèi)可見到不同階段的發(fā)育卵泡、間質(zhì)腺及黃體。
　　 4．接受兔和人新鮮及冷凍卵巢組織移植的裸鼠有動情周期恢復，其動情持續(xù)天數(shù)、動情期血清雌激素水平與正常對照組無顯著性差異(P＞0.05)，與去勢組