人體大塊卵巢組織玻璃化冷凍及異種移植研究.pdf

1、背景及目的：
　　近年來越來越多的惡性腫瘤患者受益于醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及進步，與此同時全身化療及放療帶來的弊端也日益顯現(xiàn)。年輕女性患者在接受大劑量化學藥物治療或放療的同時，性腺器官受損導致的功能衰竭或喪失等問題也隨之而來。隨著人們對生活質(zhì)量的追求越來越高，越來越多的腫瘤患者迫切的希望能夠在抗腫瘤治療前保存生殖功能。卵巢組織的冷凍保存是保存女性生殖功能的方法之一，較為常用的是經(jīng)典的慢速程序化冷凍方案，但程序化冷凍需配備要求較高的儀器設備

2、，費用昂貴，同時在細胞保存方面存在一定弊端。隨著冷凍技術(shù)的逐步提高，玻璃化冷凍技術(shù)成為近年來出現(xiàn)的一種新的冷凍方法。
　　玻璃化冷凍技術(shù)將細胞或組織等直接投入液氮中，通過快速的降溫速率，可以繞開組織內(nèi)不同細胞成分對慢速冷凍參數(shù)要求不同的技術(shù)障礙，形成一種玻璃化狀態(tài)，避免細胞內(nèi)冰晶形成，減少對細胞結(jié)構(gòu)的損傷，從而提高冷凍保存效果。然而相較于卵子、胚胎的玻璃化冷凍及卵巢組織的程序化冷凍，卵巢組織玻璃化冷凍方案仍被認為處于不成熟的實驗性

3、階段，目前國內(nèi)尚未見人卵巢組織經(jīng)玻璃化冷凍并移植后獲得成功妊娠的報道，而經(jīng)程序化冷凍并移植已見活產(chǎn)報道。
　　目前尚無標準化的卵巢組織玻璃冷凍方案，但大多數(shù)研究中所使用的卵巢組織薄片均選擇凍存小塊卵巢組織(面積<1cm2，厚度1mm)，原因可能是為了使冷凍保護劑更容易滲透。但卵巢組織過小，存在一定弊端，一方面切割過程中容易形成較多廢棄組織，而通過冷凍大塊的卵巢組織能獲取更多的卵泡，并且組織內(nèi)結(jié)構(gòu)能更好地支持卵泡生長，另一方面卵巢組

4、織在凍存過程及移植后血管再生過程中存在丟失大量卵泡的缺點?；谏鲜鲈颍瑑龃嫘K卵巢皮質(zhì)組織并進行移植的生殖力保存效果將明顯降低。
　　從理論上講，凍存一定數(shù)量的卵泡對于卵巢功能的維持及女性生殖能力的保護是有益的，對于即將接受具有明顯毒副作用大劑量放化療的女性惡性腫瘤患者來說更是如此。雖然目前應用玻璃化方法凍存人卵巢組織的研究已有陸續(xù)報道，卻鮮少見關(guān)于人體大塊卵巢組織進行玻璃化冷凍的報道。
　　本研究通過改進卵巢組織薄片的切

5、割方法調(diào)整玻璃化冷凍方案對人體大塊卵巢組織進行玻璃化冷凍，并與程序化冷凍方案的凍存效果進行比較，在解凍后進行組織學分析并采用DNA斷裂的原位末端標記法(TUNEL)進行凋亡檢測，并將卵巢組織在解凍后移植至免疫缺陷的裸鼠皮下，3周后取出，采用免疫組織化學法檢測Ki-67抗原的表達情況評估移植后卵泡活性,以探討人體大塊卵巢組織進行玻璃化冷凍的可行性。
　　材料與方法：
　　收集2013年12月-2015年9月期間鄭州大學第一附屬

6、醫(yī)院婦科行腹腔鏡下或開腹手術(shù)切除卵巢的18例人體卵巢組織，每例標本修剪成3片大塊卵巢皮質(zhì)薄片（1mm(厚)×10mm（寬）×18mm（長）），將組織薄片隨機分為三組：玻璃化冷凍組（A組），程序化冷凍組（B組），新鮮對照組（C組），對各組卵巢組織進行HE染色進行形態(tài)學分析及TUNEL染色進行凋亡檢測，在進行裸鼠異種移植后3周回收卵巢組織片計算卵泡密度檢測卵泡保存情況，并用免疫組織化學法檢測Ki-67抗原的表達情況評估卵泡活性。
　　

7、結(jié)果：
　?。?）解凍后的A組形態(tài)正常的始基卵泡比例（79.6％）與B組（74.5%）相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；
　?。?）各冷凍組卵泡凋亡發(fā)生率明顯高于新鮮對照組，但A、B組無明顯差異(P＞0.05)。間質(zhì)細胞凋亡率A組低于B組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；
　?。?）移植后各組卵泡密度無明顯差異；Ki-67抗原在卵母細胞、顆粒細胞和卵巢組織間質(zhì)細胞均有散在表達，卵泡陽性率A組與B組相比差異無統(tǒng)計學