牙鲆（Paralichthys olivaceus）胚胎玻璃化冷凍保存方法及冷凍損傷機理.pdf

1、本文以牙鲆不同發(fā)育期胚胎為實驗材料，從抗凍劑的毒性、玻璃化液的篩選、常用抗凍劑的物理特性、牙鲆胚胎的冷敏感性及冷凍損傷機理等幾個方面進行研究，對牙鲆胚胎玻璃化冷凍保存的條件進行優(yōu)化，對玻璃化冷凍過程中冷凍及解凍方式進行了探討。 首先研究了7種滲透性抗凍劑1，2-丙二醇(PG)、甲醇(MeOH)、甘油(Gly)、乙二醇(EG)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、酒精(EtOH)及5種非滲透性抗凍劑聚乙烯吡咯酮(PVP)

2、、蔗糖(Sucrose)、葡萄糖(Glucose)、葡聚糖(Dextran)、果糖(D-fructose)對牙鲆胚胎的毒性作用。結(jié)果表明，滲透性抗凍劑對牙鲆尾芽期胚胎的毒性大小依次為：EG>EtOH>Gly>DMF>DMSO>MeOH>PG；非滲透性抗凍劑中PVP對牙鲆尾芽期胚胎毒性最強，葡聚糖和葡萄糖毒性最弱；不同濃度單一抗凍劑平衡牙鲆尾芽期胚胎30min時，MeOH濃度大于27％、PG濃度大于33％時胚胎成活率迅速下降；對抗凍劑混合

3、比例進行研究，發(fā)現(xiàn)PM(PG:MeOH=3:2)與DMSO比例為3:1時混合抗凍劑對尾芽期胚胎毒性顯著小于其他混合比例。 通過對PG、MeOH、DMSO和所篩選的混合抗凍劑PMD(PG:MeOH:DMSO=9:6:5)的滲透性、冰點和最低玻璃化濃度進行研究，發(fā)現(xiàn)體積比濃度相同時，MeOH對牙鲆尾芽期胚胎的滲透最快，冰點最低，PG最低玻璃化濃度為29％，在實驗的幾種抗凍劑中最低。 對牙鲆不同時期胚胎在不同溫度下冷凍后的成活

4、率、孵化率、畸形率進行了研究，發(fā)現(xiàn)-20℃下冷凍胚胎的成活率隨冷凍時間延長而降低，隨胚胎發(fā)育期推后逐漸升高，-1℃冷凍后的胚胎的孵化率也有相似的變化趨勢，畸形率隨冷凍時間延長而升高。 對玻璃化顆粒冷凍法和麥管冷凍法進行了比較，發(fā)現(xiàn)顆粒法降溫和解凍時間均比麥管法短，玻璃化率和胚胎完整率比麥管法高，顆粒法冷凍后胚胎的損傷程度比麥管法小。 通過對不同處理后胚胎形態(tài)的觀察，發(fā)現(xiàn)五步法平衡后的胚胎卵黃囊存在輕微的損傷，平衡后死亡胚

5、胎卵黃高度聚集。冷凍對胚胎卵膜、卵黃囊、胚體及油球都會造成損傷，對胚體和卵黃囊造成損傷的可能性最大。 對超低溫冷凍過程中冷凍麥管的解凍方法進行了研究，發(fā)現(xiàn)在50℃水浴上方蒸汽中解凍時麥管的玻璃化率顯著高于直接在37℃水浴中解凍時的玻璃化率。 利用篩選到的混合抗凍劑35％PMD，加入5％的蔗糖配成玻璃化液，采用玻璃化顆粒冷凍保存方法，對牙鲆尾芽期和心跳期胚胎進行超低溫冷凍保存，凍存時間超過12h，在三次冷凍中，解凍后從17