三種海水魚類胚胎玻璃化冷凍保存研究.pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文三種海水魚類胚胎玻璃化冷凍保存研究摘要由于自然環(huán)境演變和人類生產(chǎn)活動的影響，自然水體中的魚類有相當(dāng)一部分已經(jīng)瀕臨滅絕，保護(hù)環(huán)境，保護(hù)物種已是人類面臨的一大課題。魚類配子和胚胎超低溫冷凍保存做為種質(zhì)資源長期保存的技術(shù)途徑之一，具有廣闊的應(yīng)用前景。本課題首次將玻璃化冷凍思想引入海水魚類胚胎冷凍保存研究，首次利用珍貴海水養(yǎng)殖魚類花妒(Lateolabraxjaponicus)、牙鮮CParalichthysolivaceu

2、s)和大菱鮮CScophthalmusmaximus)不同發(fā)育階段的胚胎做為實(shí)驗(yàn)材料，對海水魚類胚胎玻璃化冷凍保存技術(shù)進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究.本文首先對12一丙二醇、甲醇、二甲亞楓、甘油、二甲基甲酞胺、乙二醇、聚乙烯毗咯酮、聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇等滲透性抗劑和非滲透性抗凍劑毒性進(jìn)行了研究，認(rèn)為12一丙二醇和甲醇對魚類胚胎的毒性較低，在玻璃化液中加入聚乙烯毗咯酮有利用于玻璃化形成和防止反玻璃化現(xiàn)象發(fā)生。通過對基礎(chǔ)液鹽成分的篩選和調(diào)節(jié)，溶液滲

3、透壓和pH值的測定，胚胎在基礎(chǔ)液中培養(yǎng)研究，篩選出了適合于胚胎玻璃化冷凍保存的基礎(chǔ)液BS2o在抗凍劑毒性分析的基礎(chǔ)上，配制了80種不同成分和濃度的抗凍劑，通過冷凍和解凍時玻璃化形成能力，選擇出了適合于花妒胚胎冷凍保存的玻璃化液VSD2a在基礎(chǔ)液BS2中對抗凍劑配比進(jìn)行調(diào)整，經(jīng)過胚胎平衡實(shí)驗(yàn)，篩選出了適合于牙纖胚胎的玻璃化液PMI.PM2.PM3和PM4，適合于大菱娜胚胎的玻璃化液PMT10對PM系列玻璃化液在5℃如訪慢速降溫過程中冰點(diǎn)、

4、過冷點(diǎn)的產(chǎn)生和變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)濃度在41%以上的玻璃化液降溫時不產(chǎn)生冰點(diǎn)結(jié)晶。而40%以下玻璃化液在慢速降溫時在冰點(diǎn)出現(xiàn)了結(jié)晶。對玻璃化冷凍和解凍過程中玻璃化液溫度變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)從13℃冷至一196.2℃的降溫時間為15.4611.38sec降溫速率為8000Clmin在3545℃水浴中的解凍時間為6.6710.49sec7.2410.36sec，解凍速率約在150020000Cmin對蔗糖、葡萄糖、半乳糖、海藻糖幾種糖溶液的洗

5、脫效果進(jìn)行比較，對洗脫時華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文CryopreservationofThreeMarineFishEmbryosbyVitrificationAbstractOwingtoevolvementofnaturalenvironmentandefectofhumanbeingproductionactivitiesthewildstockofsomefishesisdecliningandsomeofthemareontheed

6、geofextinction.Ithasbecomeanimportanttasktoprotectenvironmentandwildspecies.Cryopreservationoffishgametesandembryosisoneimportantmethodofpreservinggermplasmwhichhastremendouspotentialinapplication.Vitrificationwasfirstly

7、introducedintocryopreservationofmarinefishembryosinthepresentstudy.Weusedtheseaperch(Lateolabraxjaponicas)flounder(Paralichthysofvaceus)andturbot(Scophthalmusmaximus)embryosasmaterialsandinvestigatedmarinefishembryosvitr

8、ificationtechniquesystemically.Inthispaperitwasinvestigatedthatthetoxicityofpenetrativeandnonpenetrativecryoprotectantssuchaspropyleneglycol(PG)methanol(MeOH)dimethylsulfoxide(DMSO)glycerolNNDmmethyl#ormamide(DMF)ethylen

9、eglycol(EG)polyvinylpyrrolidonum(PVP)ficoldextranandpolyethyleneglycol(PEG).ThisdissertationdemonstratedthatthepropyleneglycolandmethanolhadlowertoxicefectsonfishembryosthanothercryoprotectantsandPVPwasadvantageoustothev

10、itrificationformingandcouldalsopreventdevitrification.ThebasicsolutionBS2suitableforembryovitrificationwasselectedbychoosingthesaltcomponentdeterminingtheosmoticpressureandpHandcultivatingtheembryosinthebasicsolution.Ont

11、hebasisofthetoxicityresearchofcryoprotectants80typesofvitrificationsolutionswereconfected.VSD2suitableforthecryopreservationofseaperchembryosandPMIPM2PM3andPM4suitableforflounderembryosandPMPIsuitableforturbotembryos~cho