短時受精及胚胎玻璃化冷凍的研究.pdf

1、自從世界上第一例體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryotransfer, IVF-ET)嬰兒誕生以來，人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproductivetechnology, ART)已經(jīng)走過了37年的發(fā)展歷程。隨著人們對配子與胚胎培養(yǎng)條件的不斷優(yōu)化，輔助生殖技術(shù)的成功率顯著提高，現(xiàn)已成為治療不孕不育癥的理想治療措施之一。近年來，一系列輔助生殖相關(guān)技術(shù)，如卵子體外成熟（in vitro

2、oocyte maturation，IVM）、移植前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)、單胚胎移植(single embryotransfer, SET)以及玻璃化冷凍技術(shù)等獲得了極大的發(fā)展，為降低常規(guī)IVF-ET的費用、風(fēng)險等提供了可能。我們的目標(biāo)是安全、有效、舒適ART。而男性不育癥的兩項巨大突破是卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(introcytoplasmic sperm inject

3、ion，ICSI)的發(fā)明和無精子癥患者睪丸或附睪精子的ICSI應(yīng)用。
　　受精(Fertilization)過程是生命發(fā)生的開端，是人類生殖過程的重要環(huán)節(jié)。受精過程的一些步驟和環(huán)節(jié)仍有不十分明了，因此在目前無法準(zhǔn)確預(yù)測完全受精失敗和低受精率的情況下，如何提高受精率和可用胚率仍是研究的方向。一方面，ICSI技術(shù)本身的潛在風(fēng)險，在指證的選擇上應(yīng)該傾向于保守和嚴(yán)謹(jǐn);另一方面，IVF會出現(xiàn)不受精情況。因此，臨床醫(yī)生在選擇輔助生殖方案時，要

4、仔細(xì)詢問病史，斟酌治療方案，讓患者在第一個治療周期中盡量減少風(fēng)險。對于精液質(zhì)量較低或多年原發(fā)不孕的患者，為了避免所有卵母細(xì)胞完全不受精，將卵母細(xì)胞受精時分為兩部分:一部分進(jìn)行常規(guī)IVF，另一部分行ICSI，即分半IVF/ICSI(Half-ICSI)。
　　在臨床工作中，如果發(fā)生受精失敗或受精率低下，應(yīng)積極采取補(bǔ)救方法，一般采用IVF短時受精。即在獲卵后2-2.5小時與PESA精子短時受精，精卵共孵育4-5小時后剝除顆粒細(xì)胞，通過

5、觀察卵母細(xì)胞是否排出第二極體來推測其受精與否，對可能發(fā)生受精失敗的患者立即補(bǔ)救ICSI(rescue-ICSI，Re-ICSI)。IVF短時受精，需要觀察第二極體(polar body,Pb)判斷受精情況。明顯的2Pb和1Pb容易觀察區(qū)分，但是部分患者存在碎Pb，影響第二極體的判斷。第二極體的判斷主要受實驗室胚胎技術(shù)人員的經(jīng)驗等的影響，碎Pb在短時受精病例中的處理方式尚存在疑惑。
　　梗阻性無精子癥(obstructive azo

6、ospermia，OA)是指從生精小管到射精管任何一處發(fā)生阻塞但生精功能正常造成的無精子癥。對于OA，標(biāo)準(zhǔn)的治療方法是經(jīng)皮附睪穿刺取精(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)和ICSI。有報道PESA精子經(jīng)常規(guī)IVF或人工受精(intrauterineinsemination，IUI)能受孕并有健康嬰兒出生，這表明附睪精子在體內(nèi)和體外均具有受精能力。
　　精子低滲腫脹實驗(hy

7、poosmotic swelling test，HOS)實驗和IVF受精率及受精失敗的關(guān)系尚不明確。有學(xué)者認(rèn)為HOS實驗評分不能預(yù)測IVF受精情況。也有學(xué)者將HOS實驗根據(jù)精子尾部腫脹類型分為4個亞型HOS1-4，認(rèn)為HOS亞型對精液正常的不明原因不孕患者能提示其生育能力。自發(fā)的精子尾部腫脹(spontaneously developed tail swelling，SDTS)可能是引起HOS實驗結(jié)果差異的原因之一。IVF受精用的精液是

8、密度梯度處理后的精液，這時的精液參數(shù)與受精的關(guān)系密切，是我們研究的重點。
　　與新鮮胚胎移植周期相比，凍融胚胎移植(frozen-thawed embryotransfer, FET)周期具有更好的內(nèi)膜容受性以及胚胎與內(nèi)膜發(fā)育的同步性，且可以避免卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)。選擇全胚冷凍后擇期凍胚移植的患者，所采用的自然周期或雌孕激素替代周期更加接近自然狀態(tài)的種

9、植方式，具有良好的內(nèi)膜容受性以及內(nèi)膜與胚胎發(fā)育的同步性，所以可獲得明顯高于前者的妊娠率和種植率。隨著冷凍技術(shù)的改善，玻璃化冷凍技術(shù)減少了冷凍對胚胎的傷害，復(fù)蘇后胚胎的存活率可達(dá)95-100％。在此前提下，凡是不適合新鮮周期移植的情況都可以進(jìn)行全胚冷凍然后復(fù)蘇移植。
　　本課題擬從5個方面開展研究:
　　第一部分 經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)和短時受精用于治療梗阻性無精子癥
　　目的:對于梗阻性無精子癥患者，標(biāo)準(zhǔn)的治療方法是經(jīng)皮附

10、睪穿刺取精和卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射。PESA和常規(guī)IVF受精率低，研究OA患者PESA取精能獲得足夠數(shù)量活動精子的采用短時受精和Re-ICSI方法的效果。
　　方法:選取女方獲卵數(shù)多于10個，男方PESA獲得足夠數(shù)量優(yōu)質(zhì)精子的患者納入研究。將同源卵子隨機(jī)分為兩組，一半卵子在獲卵5小時后用市售透明質(zhì)酸酶剝除顆粒細(xì)胞行ICSI。另一半卵子在獲卵后2-2.5小時與PESA精子短時受精，精卵共孵育4-5小時后剝除顆粒細(xì)胞，觀察第二極體，再

11、決定是否行Re-ICSI。比較ICSI和Re-ICSI兩組比較兩組成熟卵子率、受精率、1PN受精率、2PN受精率、＞2PN受精率、2PN卵裂率、晚卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎率。
　　結(jié)果:OA患者平均年齡為25.6±5.3歲，女方患者年齡在22到32歲之間，平均不孕年限4.1±4.7年。共有20對夫婦，282個卵母細(xì)胞納入研究，每組141個卵母細(xì)胞。PESA短時受精組在受精4小時后顆粒細(xì)胞容易剝除，觀察沒有發(fā)現(xiàn)第二極體，行Re-

12、ICSI。因此短時受精組也是Re-ICSI組。比較ICSI和Re-ICSI兩組比較兩組成熟卵子率、受精率、1PN受精率、2PN受精率、＞2PN受精率、2PN卵裂率及晚卵裂率均相似，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。Re-ICSI組優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎率與ICSI組比較，沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:本研究對梗阻性無精子癥患者PESA取出的精子采用短時受精Re-ICSI的方法，首次發(fā)現(xiàn)未經(jīng)離心的PESA精子能消化顆粒細(xì)胞，但沒有受精能力，因此可以替

13、代合成的透明質(zhì)酸酶使用。將PESA精子用于IVF短時受精Re-ICSI和PESA精子直接行ICSI兩組比較，結(jié)果相似。認(rèn)為使用PESA得到的精子和短時受精加上Re-ICSI是治療男性梗阻性無精子癥的可行性方法。然PESA精子短時受精和Re-ICSI過程比PESA-ICSI稍復(fù)雜，但是治療OA的一種有效方式。
　　第二部分 嚴(yán)重少、弱精子癥患者行分半短時IVF/ICSI受精方式的研究
　　目的:嚴(yán)重少、弱精患者一般直接行ICS

14、I技術(shù)，然而此類患者IVF有受精的可能，探討對此類患者的卵母細(xì)胞一半行短時IVF受精，早補(bǔ)救ICSI，一半直接行ICSI受精方式。
　　方法:回顧性分析在本中心接受輔助生殖治療50個周期的精液參數(shù)為嚴(yán)重少、弱精的患者。取卵日男方精液為密度:1～5×106/ml，前向運動(PR)精子10～50％，畸形精子率＜95％的獲卵數(shù)≥10個患者。受精方式分半IVF/ICSI，其中IVF采用短時受精。即對1/2的卵行IVF短時受精，及時補(bǔ)救IC

15、SI:1/2行ICSI助孕。
　　結(jié)果:有41例病人數(shù)小時內(nèi)可留取第二次精液，第二次精液液化時間短，精液量少，密度稍低，但PR精子百分率高，有統(tǒng)計學(xué)意義;50周期中17周期IVF受精:比較同源卵子行IVF和ICSI受精率、卵裂率、可用胚胎數(shù)及優(yōu)胚數(shù)，IVF受精率低于ICSI，差異有顯著性，但可用胚胎數(shù)和優(yōu)胚數(shù)兩組無差異;50周期中33周期IVF受精失敗，其中31周期6小時后去除顆粒細(xì)胞觀察Pb，所有的減數(shù)第二次分裂中期(metap

16、haseⅡ，MⅡ)卵均未見2個Pb者，及時行Re-ICSI。另2例雖部分卵子可見2個Pb，但I(xiàn)VF均未受精;31例Re-ICSI周期中同源卵子ICSI與Re-ICSI比較，受精率，卵裂率，可用胚胎數(shù)兩組無差異，優(yōu)胚率Re-ICSI稍高，差異無顯著性。
　　結(jié)論:嚴(yán)重少、弱精癥患者采用分半短時IVF/ICSI受精方式，其中IVF采用短時受精。即對1/2的卵行IVF短時受精，及時補(bǔ)救ICSI;1/2行ICSI助孕。首次將Half-IC

17、SI和IVF短時受精Re-ICSI相結(jié)合。男方精液必要時可留取第二次精液，第二次精液液化時間短，精液量少，密度稍低，但PR精子百分率高。處理后只要有足夠的精子，IVF有受精的可能，短時受精Re-ICSI周期中同源卵子ICSI與Re-ICSI有相似的結(jié)局。對嚴(yán)重的少、弱精癥患者如果IVF可受精則優(yōu)先選取IVF受精來源的胚胎進(jìn)行移植，是另一種可行的預(yù)防常規(guī)IVF受精失敗的授精方式，此方法一定程度避免了ICSI來源胚胎的移植，也可獲得滿意的妊

18、娠結(jié)局。
　　第三部分 碎極體對短時受精補(bǔ)救ICSI影響的研究
　　目的:探討碎極體在短時受精Re-ICSI中不同處理方式對受精情況的影響。
　　方法:IVF短時受精后去除顆粒細(xì)胞觀察第二極體。根據(jù)Pb情況分為三組，組①:即IVF完全受精失敗周期，所有MⅡ卵均未見2Pb，1 Pb和碎Pb卵子均行Re-ICSI;組②:2Pb占MⅡ卵≥30％時，全部卵子不行Re-ICSI;組③:即受精率低下周期，2Pb占MⅡ卵＜30％時，

19、1Pb卵子行Re-ICSI，碎Pb卵子不行Re-ICSI。
　　結(jié)果:177個短時受精周期，碎Pb卵子共197枚，占MⅡ卵比例12.1％(197/1632)。組①41周期，其中1 Pb卵子328枚、碎Pb卵子49枚，無2Pb卵子;組②103周期，期中1 Pb卵子173枚、碎Pb卵子112枚，2Pb卵子668枚;組③33周期，期中1 Pb卵子203枚、碎Pb卵子36枚和2Pb卵子63枚。組①中碎Pb和1Pb行Re-ICSI2PN受精

20、率分別為81.6％和82.0％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);組①中碎Pb和1Pb行Re-ICSI多PN受精率分別為6.1％和3.9％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);組②和組③中碎Pb IVF2PN受精率分別為19.6％和16.7％，均低于2Pb IVF2PN受精率79.8％和71.4％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);組②和組③中碎Pb IVF多PN受精率分別為4.5％和5.5％，與2Pb IVF多PN受精率3.9％和3.2

21、％相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;組①中Re-ICSI2PN受精率82.6％(309/374)和組③Re-ICSI2PN受精率81.8％相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:IVF短時受精，需要觀察第二極體判斷受精情況。明顯的2Pb和1Pb容易觀察區(qū)分，但是部分患者存在碎Pb，影響第二極體的判斷。碎Pb占MⅡ卵比例12.1％(197/1632)。因此，碎極體在短時受精Re-ICSI中正確處理對提高卵子利用率及

22、妊娠結(jié)局有很大影響。本研究認(rèn)為碎極體在不同受精情況下應(yīng)區(qū)別對待:所有的MⅡ卵均未見2Pb患者碎Pb應(yīng)和1Pb同樣對待，均行Re-ICSI。部分MⅡ卵有Pb2患者碎Pb均不行Re-ICSI，這樣IVF受精率雖然稍低，但避免出現(xiàn)重復(fù)受精的可能。這可能是我們多PN發(fā)生率并未增加的原因。
　　第四部分 精子低滲腫脹試驗在短時受精完全受精失敗中的作用
　　目的:比較精子低滲腫脹實驗亞型在短時受精完全受精失敗組和正常受精組中的區(qū)別。

23、r>　　方法:原發(fā)不孕獲卵數(shù)多于7個的患者行短時受精，對所有成熟卵母細(xì)胞均未見第二極體的行Re-ICSI，18小時后觀察可見正常2原核(pronucleus，PN)的為完全受精失敗組(total fertilization failure，TFF)，共有42對夫婦納入研究。選取同期IVF短時受精正常，未行Re-ICSI的為對照組。HOS根據(jù)精子尾部腫脹部位分為4個亞型HOS1，HOS2，HOS3，和HOS4，并排除SDTS，在精液密度梯

24、度離心處理前和處理后分別計數(shù)HOS4個亞型和SDTS。比較TFF組和受精正常組HOS差異。
　　結(jié)果:TFF組和對照組患者女方年齡，男方年齡，不孕年限和基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);精液密度梯度離心處理前完全受精失敗組和對照組患者HOS1～4比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）;在除外SDTS后兩組HOS1～4比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。精液密度梯度離心處理后完全受精失敗組和對照組患者HOS1～4比較，均

25、無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞O.05);除外SDTS后的兩組HOS1，2，4比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），HOS3在受精正常組明顯高于完全失敗組，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。精液密度梯度處理在除外SDTS后HOS3于20的患者應(yīng)警惕IVF受精失敗的可能。但有部分患者HOS3與正常組相似，這部分患者完全受精失敗的原因可能是卵子方面的原因。
　　結(jié)論:對接受助孕治療的夫婦對精液常規(guī)分析未見明顯異?；颊呷绾晤A(yù)防完全受精失敗或低受精

26、率成為改善這些患者IVF結(jié)局的重要環(huán)節(jié)。本實驗將精子低滲腫脹實驗根據(jù)精子尾部腫脹部位分為4個亞型HOS1，HOS2，HOS3，HOS4;排除了SDTS對HOS實驗的影響;除了比較精液處理前的情況，對梯度離心后直接受精的精液也進(jìn)行了研究。認(rèn)為精液密度梯度處理在除外SDTS后HOS3低的患者應(yīng)警惕IVF受精失敗的可能。但有部分患者HOS3與正常組相似，這部分患者完全受精失敗的原因可能是卵子方面的原因。
　　第五部分 IVF獲卵數(shù)、胚胎

27、玻璃化冷凍與體外受精胚胎移植妊娠結(jié)局的關(guān)系
　　目的:探討控制性超促排卵(COH)中獲卵數(shù)對IVF-ET妊娠結(jié)局的影響，及為避免重度OHSS采用自制麥管載體全胚冷凍的效果。
　　方法:接受常規(guī)IVF助孕治療的不孕癥患者358例(除外ICSI，Half-ICSI，Re-ICSI)。根據(jù)獲卵數(shù)不同分為三組，其中獲卵數(shù)1～10者122例（Ⅰ組），獲卵數(shù)11～20者183例（Ⅱ組），獲卵數(shù)＞20者53例(Ⅲ組);358例中發(fā)生OHS

28、S48例全胚冷凍，其中Ⅰ組無全胚冷凍，Ⅱ組全胚冷凍28例，Ⅲ組全胚冷凍20例。胚胎冷凍采用自制麥管載體。
　　結(jié)果:三組OHSS發(fā)生率比較:358例中新鮮移植組310例，發(fā)生OHSS全胚冷凍組48例。三組全胚冷凍率分別為0，15.3％和37.7％，差異有顯著性;全胚冷凍組與新鮮移植組比較:年齡及優(yōu)胚率無明顯差異，著床率及臨床妊娠率無明顯差異;新鮮移植第Ⅲ組著床率及臨床妊娠率低于全胚冷凍第Ⅲ組，差異有顯著性。
　　結(jié)論:隨著獲