小鼠卵巢組織的玻璃化冷凍保存技術(shù)研究.pdf

1、卵巢組織冷凍保存技術(shù)是生殖工程的重要側(cè)面之一，可為受精機(jī)制研究和體細(xì)胞核移植研究等需要儲(chǔ)備和供應(yīng)卵源的課題提供技術(shù)保障。迄今為止，卵巢組織的冷凍保存雖然已取得了一系列進(jìn)展但技術(shù)仍不完善，玻璃化冷凍方法為生物組織保存提供了新的途徑，但尚未形成完善的技術(shù)體系。 冷凍操作方法和冷凍保護(hù)液是影響玻璃化冷凍效果的兩個(gè)重要因素。在以往的研究中，冷凍復(fù)蘇的卵母細(xì)胞和卵巢組織都有部分能夠發(fā)育到囊胚或者生育幼仔，說(shuō)明冷凍復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞及或各級(jí)卵

2、泡保持了正常的發(fā)育潛能。但是，采用常規(guī)程序冷凍法和常規(guī)玻璃化冷凍法保存的卵巢組織，或者復(fù)蘇率不高，或者方法繁瑣，而且對(duì)分離的竇前卵泡的冷凍保存研究較少。本研究采用分離卵泡為材料分別研究了不同的玻璃化冷凍操作方法和不同的冷凍保護(hù)液配方，并對(duì)小鼠卵巢組織片進(jìn)行玻璃化冷凍試驗(yàn)。采用從小鼠卵巢分離的竇前卵泡為材料，采用Dinnyes等相同的玻璃化冷凍保護(hù)液，比較了常規(guī)玻璃化法、液氮網(wǎng)籃法、-205℃玻璃化法、-205℃表面玻璃化法4種不同操作方

3、法的冷凍保護(hù)效果；之后，采用上述實(shí)驗(yàn)獲得的最佳冷凍方法，選擇三種玻璃化冷凍保護(hù)劑配方，冷凍保存從小鼠卵巢分離的竇前卵泡，比較各種配方的冷凍效果，探索建立適宜的竇前卵泡快速玻璃化冷凍保存方法和選擇合適的玻璃化冷凍保護(hù)液。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步冷凍小鼠卵巢組織塊，觀察復(fù)蘇后分離卵泡的存活率和貼壁率。 結(jié)果顯示： (1)在冷凍操作方法研究方面，實(shí)驗(yàn)A中，采用液氮網(wǎng)籃和-205℃玻璃化兩種冷凍方法的卵泡復(fù)蘇率明顯高于常規(guī)玻璃化的復(fù)蘇

4、率，而兩者之間無(wú)差異；實(shí)驗(yàn)B中，采用-205℃表面玻璃化和液氮網(wǎng)籃兩種方法冷凍的卵泡復(fù)蘇率有顯著性差異，-205℃表面玻璃化和-205℃玻璃化兩種方法冷凍的卵泡復(fù)蘇率有顯著性差異，而液氮網(wǎng)籃和-205℃玻璃化冷凍的卵泡復(fù)蘇率無(wú)差異，-205℃表面玻璃化方法冷凍小鼠竇前卵泡復(fù)蘇率達(dá)83.02％±4.10％。 (2)在冷凍保護(hù)液研究方面，比較了三種玻璃化冷凍保護(hù)液冷凍保存小鼠竇前卵泡的復(fù)蘇率，兩兩之間均有顯著性差異。其中冷凍保護(hù)液A

5、的復(fù)蘇率為18.54％，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為2.65，變異系數(shù)(CV)為14.27；冷凍保護(hù)液B的復(fù)蘇率為98.39％，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為1.88，變異系數(shù)(CV)為1.91；冷凍保護(hù)液C的復(fù)蘇率為5.83％，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為0.38，變異系數(shù)(CV)為6.57。冷凍保護(hù)液B的冷凍保存效果最好。 (3)在小鼠卵巢組織玻璃化冷凍保存方面，復(fù)蘇后卵巢組織需要孵育一段時(shí)間才能恢復(fù)生長(zhǎng)發(fā)育功能，孵育的時(shí)間不同，對(duì)其分離卵泡的復(fù)蘇率和貼壁率亦不