兔卵巢組織冷凍復(fù)蘇后自體移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、卵巢是維持女性生殖和內(nèi)分泌功能的重要器官，化療、放療、遺傳、感染和自身免疫因素等引起的卵巢早衰給女性帶來(lái)極大的痛苦。卵巢的冷凍和移植作為恢復(fù)女性生殖和內(nèi)分泌功能的一種手段具有較高的臨床價(jià)值，特別是對(duì)于不可能凍存胚胎或卵母細(xì)胞的兒童患者，冷凍保存卵巢皮質(zhì)是她們唯一的選擇。一定數(shù)量的卵泡是維持卵巢功能的基礎(chǔ)，卵巢組織凍存移植的目標(biāo)在于不斷改進(jìn)凍存移植技術(shù)使移植后獲得盡可能多的存活卵泡，更利于移植后卵巢組織功能的恢復(fù)及長(zhǎng)期維持。目前卵巢組織冷

2、凍移植的研究方向主要包括冷凍方案的優(yōu)化、最佳移植部位的選擇、移植卵巢組織中促性腺激素受體的變化以及卵母細(xì)胞的成熟和受精發(fā)育潛能的探討等。 卵巢皮質(zhì)含有豐富的始基卵泡，這些卵泡處于靜止?fàn)顟B(tài)，代謝率低，無(wú)透明帶和皮質(zhì)顆粒，因此可以較好地耐受冷凍。但凍融過(guò)程中由于細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成和鹽的沉積，可導(dǎo)致細(xì)胞功能不可逆的損害。最理想的結(jié)果是在細(xì)胞內(nèi)形成“玻璃化”，即液體在冷凍過(guò)程中不形成冰晶，只呈現(xiàn)出粘度極度增加的一種狀態(tài)，此過(guò)程不發(fā)生生物學(xué)

3、變化。玻璃化冷凍方法的原理是采用高濃度的冷凍保護(hù)劑組成玻璃化保存液，在低溫下快速冷凍形成玻璃化狀態(tài)，完全消除冰晶的形成，玻璃化冷凍技術(shù)因其經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便和高效而成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在人類(lèi)輔助生殖領(lǐng)域也出現(xiàn)了玻璃化冷凍技術(shù)的應(yīng)用研究，主要針對(duì)人類(lèi)胚胎和卵子，而卵巢組織玻璃化冷凍方面的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)比較玻璃化冷凍和慢速冷凍后兔卵巢組織形態(tài)學(xué)和DNA損傷情況，探討玻璃化冷凍技術(shù)在冷凍卵巢組織方面的應(yīng)用前景。 卵巢組織凍存的目的

4、是將卵巢移植回體內(nèi)，在一定程度上恢復(fù)卵巢的內(nèi)分泌功能和生育能力。卵巢移植根據(jù)供體和受體的關(guān)系可分為自體移植、異體移植和異種移植。其中異體移植和異種移植面臨的最大問(wèn)題是免疫排斥反應(yīng)，因而限制了它們的臨床應(yīng)用。自體卵巢移植臨床上適用于患有嚴(yán)重的婦科疾病或腫瘤而并未累及卵巢的患者，可于接受放、化療前進(jìn)行卵巢冷凍保存，治療結(jié)束后再行自體移植，從而保留卵巢功能，使卵巢免受放、化療的損傷。移植部位對(duì)保存移植后卵巢功能的恢復(fù)及存活至關(guān)重要。理想的移植

5、部位應(yīng)該能夠較快地為移植物建立血液供應(yīng)，有足夠的空間并且能提供優(yōu)良的存活條件，而且便于卵泡監(jiān)測(cè)和取卵或能自然排卵。目前，最佳的自體移植部位尚不確定。自體移植根據(jù)移植部位的不同可分為原位移植和異位移植。原位移植是指將卵巢組織移植到盆腔卵巢窩、卵巢蒂位置或卵巢內(nèi)，但卵巢及其周?chē)捎诳臻g的限制使可接受的移植物數(shù)量較少。常用的異位移植部位包括腎被膜下、前臂皮下、乳房組織下、腹直肌筋膜下和腹壁皮下等。腎被膜下因其有豐富的血供而被認(rèn)為是較好的移植部

6、位之一，但來(lái)自于被膜的壓力可能會(huì)限制生長(zhǎng)卵泡的發(fā)育。同時(shí)研究認(rèn)為皮下空間溫度和壓力的變化對(duì)卵子會(huì)有損傷，可能會(huì)影響卵子的質(zhì)量。子宮系膜，為子宮闊韌帶的主要部分，內(nèi)含豐富的子宮血管、淋巴管、神經(jīng)及大量疏松結(jié)締組織。其血供豐富(易于建立血液供應(yīng))、組織疏松(易于移植并能提供足夠的發(fā)育空間)且范圍廣(可容納較多的移植物)，有望成為較理想的移植位點(diǎn)。本研究將凍融的兔卵巢組織分別移植于子宮系膜內(nèi)、腹壁皮下及腎被膜下，觀察移植后的卵巢組織形態(tài)學(xué)、超

7、微結(jié)構(gòu)、卵泡生長(zhǎng)發(fā)育狀況，以探討不同移植部位的移植效果。卵巢移植后，能否接受母體促卵泡素(Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和促黃體生成素(Luetinizing hormone，LH)的刺激而迅速發(fā)育，取決于存活的卵巢移植物中是否存在促卵泡素受體(Follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)和促黃體生成素受體(Luetinizing hormone recept

8、or，LHR)。研究卵巢組織移植物中促性激素受體表達(dá)的變化有助于了解異位卵泡生長(zhǎng)啟動(dòng)和發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究通過(guò)比較凍融移植前后卵巢組織內(nèi)FSHR和LHR的變化，以期為移植后促性腺激素的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。 近年來(lái)陸續(xù)有多種動(dòng)物凍融卵巢組織移植后恢復(fù)生殖力的報(bào)道，人類(lèi)也有卵巢組織冷凍復(fù)蘇后移植成功妊娠分娩的報(bào)道。但異位的生長(zhǎng)環(huán)境是否會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞的成熟和受精發(fā)育能力造成影響，文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論不一。為進(jìn)一步研究?jī)鋈谝浦彩欠駮?huì)影響卵母

9、細(xì)胞的質(zhì)量，本研究將復(fù)蘇的兔卵巢組織自體異位多點(diǎn)移植于子宮系膜內(nèi)，對(duì)冷凍移植后卵母細(xì)胞的發(fā)育、體內(nèi)和體外成熟以及受精、卵裂、囊胚形成及染色體異常情況進(jìn)行觀察，以期為進(jìn)行人類(lèi)卵巢組織的冷凍移植奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一部分:兔卵巢組織玻璃化冷凍與慢速冷凍的比較 [目的]探討玻璃化冷凍方法對(duì)兔卵巢組織冷凍保存的效果。 [方法]將30只新西蘭雌兔的雙側(cè)卵巢切除，每個(gè)卵巢的組織塊隨機(jī)分為三部分，分別組成對(duì)照組、慢速冷凍組和玻璃

10、化冷凍組，卵巢組織分別進(jìn)行慢速冷凍和玻璃化冷凍，比較凍融前后卵巢組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、DNA損傷(原位末端標(biāo)記法，TUNEL)情況。 [結(jié)論]玻璃化冷凍可有效保存卵巢組織的結(jié)構(gòu)，是一種簡(jiǎn)單、可行的兔卵巢組織冷凍保存方法。 第二部分:兔卵巢組織不同移植部位移植效果的比較和移植后促性腺激素受體表達(dá)的研究 [目的]篩選理想的卵巢組織移植部位，并探討凍融移植后促性腺激素受體的表達(dá)情況。 [方法]30只切除雙側(cè)卵巢的新

11、西蘭雌兔隨機(jī)分為3組，將玻璃化冷凍復(fù)蘇的卵巢組織分別自體移植到子宮系膜內(nèi)、腹壁皮下和腎被膜下。30d后取出卵巢組織，通過(guò)卵巢組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、以及陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查，觀察移植后卵巢組織存活、卵泡生長(zhǎng)發(fā)育及內(nèi)分泌功能恢復(fù)情況。運(yùn)用免疫組化ABC法對(duì)兔移植前后的卵巢組織中FSHR和LHR.分別進(jìn)行定位染色，結(jié)合圖像分析系統(tǒng)對(duì)凍融移植前后卵巢組織內(nèi)FSHR和LHR的表達(dá)進(jìn)行分析。 [方法]25只性成熟新西蘭雌兔隨機(jī)分為對(duì)照組(5只)、

12、新鮮移植組(10只)及冷凍復(fù)蘇移植組(10只)，兩移植組中卵巢組織均自體多點(diǎn)移植于子宮系膜內(nèi)。卵巢移植90d后對(duì)兔聯(lián)合使用促排卵、體外成熟(IVM)培養(yǎng)和體外受精(IVF)/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)，觀察卵子的成熟情況以及體內(nèi)和體外成熟卵子的受精率、卵裂率和囊胚形成率。 [結(jié)果]新鮮移植組和冷凍復(fù)蘇移植組中每高倍視野卵泡數(shù)均低于對(duì)照組(P＜0.05)；各組間未成熟卵子所占比率以及未成熟卵子體外成熟率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義(P＞0.05)；各組間體內(nèi)成熟卵子、體外培養(yǎng)成熟卵子的受精率、卵裂率和囊胚形成率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)：各組內(nèi)體內(nèi)成熟卵子與體外培養(yǎng)成熟卵子的受精率和卵裂率間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但體外培養(yǎng)成熟卵子的囊胚形成率明顯低于體內(nèi)成熟卵子(P＜0.05)。 [結(jié)論]兔卵巢經(jīng)冷凍復(fù)蘇自體移植后，其卵泡能夠重新生長(zhǎng)發(fā)育，結(jié)合體外成熟和體外受精技術(shù)體內(nèi)和體外成熟卵子均可發(fā)育至囊胚期。證實(shí)卵巢組織凍融移植

14、結(jié)合輔助生殖技術(shù)可作為一種生育力保存的方法。 玻璃化冷凍方法可有效保存兔卵巢組織，因其簡(jiǎn)單、快捷、無(wú)冰晶形成，所以該方法在動(dòng)物卵巢組織凍存移植乃至開(kāi)展人類(lèi)輔助生育研究方面具有良好的應(yīng)用前景。子宮系膜能為移植物提供良好的生存環(huán)境，移植后的卵巢組織形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，卵泡存活并正常發(fā)育，因此卵巢組織子宮系膜內(nèi)移植可作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的有效方法，并有望應(yīng)用于臨床治療。卵巢組織凍融移植并未影響卵巢組織中促卵泡素受體和促黃體生成素受體的