補腎對凍存后自體移植小鼠卵巢功能影響的研究.pdf

1、目的：研究補腎對凍存后自體異位移植卵巢卵泡存活和卵泡發(fā)育的影響并探討其作用機制。
　　方法：本研究以腎主生殖理論為指導，將小鼠冷凍復蘇卵巢自體異位移植，異位移植小鼠隨機分為六組，分別為五子衍宗丸組（五子組）、左歸丸組（左歸組）、右歸丸組（右歸組）、PMSG組、模型組和正常組，并采取術前、術后和全程用藥3種不同給藥方式，以同期模型組為對照，移植后7、21和35天回收移植卵巢組織，采用組織學、免疫組化、體外成熟、體外受精和實時定量PC

2、R等方法對凍存后自體異位移植卵巢卵泡生長、卵母細胞發(fā)育和相關基因表達進行研究。
　　結果：⑴本次實驗摘除卵巢再移植小鼠246只，摘除凍存移植卵巢492個。有效回收卵巢338個，凍存移植卵巢總有效回收率為68.70％。移植卵巢7d、21d和35d，各組卵巢回收率與模型組比較表明：五子衍宗丸顯著提高凍存卵巢自體異位移植后的存活率（p＜0.01）；移植前使用五子衍宗丸提高凍存后自體異位移植卵巢的存活率（p＜0.05）； PMSG提高凍存

3、卵巢自體異位移植后的存活率（p＜0.05）。卵巢自體異位移植第7天，各組凍存后自體異位移植卵巢都未觀察到竇狀卵泡和排卵前卵泡，移植第21天和第35天，自體異位移植卵巢觀察到原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡等各級卵泡生長，五子衍宗丸組最顯著。自體異位移植卵巢組織經VEGF免疫組化方法檢測，移植第七天，自體異位移植卵巢組織皮質及其外周組織VEGF表達有不同程度的增加。移植21天和35天，在各級卵泡細胞和顆粒細胞之外的間質細胞VEGF有

4、增強表達。TUNEL細胞凋亡原位檢測（FITC標記）凍存后自體異位移植卵巢組織，7d組中，細胞凋亡陽性表達面積廣泛，21d和35d組中，隨著移植卵巢卵泡逐漸生長，凋亡陽性細胞的表達區(qū)間逐步縮小，間質是凋亡陽性細胞的主要表達部位。卵巢移植后第21天，五子衍宗丸組血清雌二醇（3.26±0.17 ng/ml）水平最高，且與模型組、左歸組和右歸組比較有統(tǒng)計學差異（p＜0.05），表明五子衍宗丸較左、右歸丸能夠更好的促進自體異位移植卵巢組織卵泡發(fā)

5、育。⑵自體異位移植卵巢第21天和第35天，各組凍存后自體異位移植卵巢共回收卵母細胞64枚和69枚，僅五子衍宗丸組回收有GV期和MⅡ期卵母細胞，細胞形態(tài)與正常組回收卵母細胞一致。各組卵母細胞數量與模型組比較，表明五子衍宗丸、右歸丸和PMSG提高凍存卵巢自體異位移植后卵母細胞數量（p＜0.05）；隨給藥次數增加，五子衍宗丸和右歸丸促進移植卵巢功能進一步恢復，數量增加（p＜0.05）。本次實驗，五子衍宗丸組未成熟卵母細胞經體外培養(yǎng)后發(fā)育到MⅡ

6、期，成熟卵母細胞經體外受精，發(fā)育到2-細胞和桑葚胚階段。表明五子衍宗丸不僅提高凍存卵巢自體異位移植后卵母細胞數量，還可有效恢復凍存后自體異位移植卵巢卵母細胞的發(fā)育能力。⑶凍存移植卵巢和正常卵巢均可檢測到目的基因GDF-9、AMH、FSHR、LHR、VEGF、Ang2、Bax、Bcl-2、fas和fasl mRNA的表達。通過檢測各組目的基因，與模型組比較，通過細胞凋亡Bcl-2/Bax通路和血管新生調節(jié)通路，五子衍宗丸改善早期凍存后自體