GnRHa對(duì)裸鼠卵巢癌移植瘤模型的化療效果影響及卵巢功能保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　 卵巢癌目前仍是婦科惡性腫瘤中婦女首要的死亡原因。目前卵巢癌的發(fā)病日趨年輕化，且多數(shù)確診時(shí)已到晚期。傳統(tǒng)手術(shù)治療、放、化療及生物治療等治療措施療效有限，不良反應(yīng)大，5年生存率徘徊在30％左右。順鉑為目前治療卵巢腫瘤的一線化療藥物。但順鉑不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺滅作用，同時(shí)也對(duì)正常的卵巢組織，特別是卵母細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致卵巢功能下降甚至早衰（premature ovarian failure）。文獻(xiàn)報(bào)道80％卵巢癌細(xì)胞表達(dá)G

2、nRH受體，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GnRH類似物通過(guò)與GnRH受體結(jié)合發(fā)揮直接抑制腫瘤生長(zhǎng)和抗增殖作用、誘導(dǎo)凋亡作用。有實(shí)驗(yàn)研究促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（gonadotropin-releasing hormone agonist GnRHa）可能抑制下丘腦-垂體-性腺軸，阻止原始卵泡的募集及進(jìn)一步發(fā)育成熟，在腫瘤化療過(guò)程中有卵巢功能保護(hù)的作用。目前甚少有研究關(guān)于卵巢腫瘤化療過(guò)程中應(yīng)用GnRHa對(duì)化療效果的影響。故通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)研究順鉑化療過(guò)

3、程中應(yīng)用GnRHa對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響及是否有卵巢功能保護(hù)作用，以尋求既提高卵巢癌患者的生存質(zhì)量又不影響腫瘤化療效果的治療方法，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。
　　 目的：
　　 通過(guò)建立裸鼠上皮性卵巢癌移植瘤動(dòng)物模型，并應(yīng)用順鉑化療及聯(lián)合應(yīng)用 GnRHa（曲普瑞林），探討GnRHa對(duì)順鉑化療效果的影響及對(duì)卵巢功能保護(hù)作用。
　　 （一）構(gòu)建動(dòng)物模型及探討GnRHa的卵巢功能保護(hù)作用
　　 方法：

4、　　 1．人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3在高糖型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，0.25％胰蛋白酶消化3min，終止反應(yīng)，制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/ml。
　　 2．4只裸鼠進(jìn)行成瘤預(yù)實(shí)驗(yàn)。在SPF環(huán)境超凈工作臺(tái)內(nèi)，以75％酒精消毒腹部皮膚，腹腔接種0.2ml細(xì)胞懸液，觀察兩組動(dòng)物成瘤情況。
　　 3．觀察1月后取腫瘤組織進(jìn)行HE染色病理學(xué)檢查及腹腔腫瘤原代培養(yǎng)，確定病理結(jié)果為低分化卵巢漿液

5、性囊腺癌及原代細(xì)胞培養(yǎng)與OVCAR-3一致。再取24只裸鼠隨機(jī)分為4組按預(yù)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行動(dòng)物接種，成瘤后遂將24只裸鼠隨機(jī)分為4組：即對(duì)照組[腹腔注射生理鹽水（NS）0.2ml/w×6w]、順鉑組(第一天腹腔注射NS0.2ml，2周后腹腔注射順鉑5mg/w×4w)、GnRHa+NS組(GnRHa0.3mg皮下注射，2周后NS0.2ml/w腹腔注射×4w)、聯(lián)合用藥組(GnRHa0.3mg皮下注射，2周后順鉑腹腔注射5mg/w×4w)；每組

6、6只。每周稱裸鼠體重。
　　 4．卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)數(shù)具有正常結(jié)構(gòu)的原始卵泡及生長(zhǎng)卵泡數(shù)。
　　 5．小鼠血清抗苗勒管激素（AMH）ELISA檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 裸鼠腹腔接種后第10天可觀察到腹部稍膨隆，活動(dòng)減少，腹腔進(jìn)針處可見(jiàn)米粒樣大小結(jié)節(jié)，各組體重增長(zhǎng)曲線見(jiàn)附圖；打開(kāi)腹腔，可見(jiàn)腫瘤結(jié)節(jié)分布于腸管、腹膜表面、腸系膜為主，直徑約3-15mm（見(jiàn)附圖）。僅有對(duì)照組中1只裸鼠尸解時(shí)發(fā)現(xiàn)有淡黃色腹水

7、約0.4ml。總成瘤率為96％。腹腔腫瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)與OVCAR-3細(xì)胞形態(tài)一致。病理學(xué)檢查結(jié)果：為低分化卵巢漿液性囊腺癌。腫瘤組織呈團(tuán)塊狀，侵犯脂肪組織及橫紋肌組織；細(xì)胞核核漿比例增大，細(xì)胞漿透明空泡狀，部分紅染；細(xì)胞核呈卵圓或不規(guī)則形，見(jiàn)有核仁，并可見(jiàn)散在凋亡細(xì)胞（圖2、3）。
　　 用藥后對(duì)照組裸鼠卵巢形態(tài)正常，順鉑腹腔注射給藥后卵巢組織肉眼觀卵巢組織體積縮小，表面凸凹不平。4組雙側(cè)卵巢重量、卵巢原始卵泡數(shù)及生長(zhǎng)卵泡數(shù)

8、見(jiàn)表1。順鉑組卵巢重量明顯降低，與其它三組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組與對(duì)照組、GnRHa組兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組裸鼠卵巢原始卵泡數(shù)、生長(zhǎng)卵泡數(shù)分別比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。順鉑組原始卵泡數(shù)、生長(zhǎng)卵泡數(shù)明顯少于其余三組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但聯(lián)合用藥組分別與對(duì)照組、GnRHa組兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。用藥后，4組裸鼠血清中AMH水平見(jiàn)表1，

9、各組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。順鉑組明顯低于其余三組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但聯(lián)合用藥組分別與對(duì)照組、GnRHa組兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 應(yīng)用人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3構(gòu)建裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤的方法簡(jiǎn)單易行，4×106/0.2ml即能成瘤，能夠較完整保持了人卵巢漿液性囊腺癌的特點(diǎn)；順鉑對(duì)裸鼠卵巢功能具有損害作用；GnRHa不僅對(duì)順鉑引起的裸鼠卵巢功能

10、損害具有保護(hù)作用，在化療早期還能明顯減少化療引起體重下降的副作用。
　　 （二）探討GnRHa對(duì)順鉑化療效果的影響
　　 方法：
　　 1．各用藥組裸鼠腫瘤組織重量及增殖抗原ki67免疫組化評(píng)分
　　 2．透射電鏡標(biāo)本制備并觀察腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況
　　 3．腫瘤組織半胱胺酸蛋白酶蛋白-3（Caspase-3）及NFkb檢測(cè)
　　 結(jié)果：
　　 1．4組裸鼠腫瘤組織重量及增殖抗原k

11、i67免疫組化評(píng)分見(jiàn)表2，4組裸鼠腫瘤組織重量分別比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，順鉑組與聯(lián)合用藥組腫瘤重量明顯低于對(duì)照組及GnRHa組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；順鉑組與聯(lián)合用藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組與GnRHa組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2．對(duì)照組未發(fā)生凋亡的卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞膜，線粒體、細(xì)胞核等細(xì)胞器正常；而在經(jīng)順鉑、GnRHa、GnRHa+順鉑處理后的三組用藥組

12、呈細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核深染，染色質(zhì)濃縮成塊并邊集，其中以早、中、晚期凋亡為最具特征性改變。細(xì)胞凋亡早期：細(xì)胞核染色體發(fā)生邊集,核形不規(guī)整,核膜表面凹凸;凋亡中期：核內(nèi)染色質(zhì)凝聚,趨邊呈月牙狀,核膜孔消失,核膜呈波紋狀皺縮;凋亡晚期：核固縮,細(xì)胞膜出芽形成小泡,可見(jiàn)凋亡小體。
　　 3．三組用藥組，順鉑組、GnRHa+NS組、聯(lián)合用藥組NFkb表達(dá)下調(diào)，Caspase-3表達(dá)上調(diào)。與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（