裸鼠荷人卵巢癌皮下移植瘤模型的建立及藥效研究和基因突變的檢測.pdf

1、研究目的：
　　1.收集術(shù)中切除的新鮮上皮性卵巢癌組織，建立具有多種組織學(xué)類型的大樣本裸鼠移植瘤模型；觀察移植瘤生長特點(diǎn)，探討臨床病理因素與移植瘤成瘤率的關(guān)系，并對比觀察裸鼠移植瘤組織與原人卵巢癌組織、細(xì)胞系移植瘤組織的形態(tài)學(xué)特征。為系統(tǒng)性研究卵巢癌的發(fā)病、生物學(xué)特性、基因表型、臨床前藥效學(xué)檢測等方面提供較好的研究平臺。
　　2.應(yīng)用裸鼠荷人卵巢癌移植瘤模型，觀察泰素(紫杉醇)、卡鉑和順鉑對移植瘤的療效，結(jié)合臨床用藥效果進(jìn)一

2、步探討裸鼠荷人卵巢癌移植瘤模型在藥效學(xué)方面的應(yīng)用價(jià)值。
　　3.采用高通量方法檢測卵巢癌第五代裸鼠移植瘤組織的基因突變，結(jié)合文獻(xiàn)篩選卵巢癌相關(guān)基因，進(jìn)一步探討在卵巢癌進(jìn)展過程中是否存在某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常，為研發(fā)新的抗腫瘤藥物提供依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.無菌條件下收集術(shù)中冰凍證實(shí)為上皮性卵巣癌的瘤組織，6h內(nèi)接種至裸鼠背部皮下(4點(diǎn)/只)，3～5只/例，觀察原代移植瘤的生長情況。移植瘤6m內(nèi)繼續(xù)生長并且腫瘤體

3、積達(dá)到500mm3者為原代成瘤，隨后再次傳代。連續(xù)傳代過程中移植瘸在接種60天內(nèi)體積能達(dá)到800mn3并進(jìn)行傳代者為建模成功。從第三代開始測量裸鼠體重和腫瘤體積，繪制生長曲線。將原發(fā)瘤、第一代移植瘤、第五代移植瘤和人卵巢癌細(xì)胞系移植瘤組織進(jìn)行HE染色并對比觀察其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
　　2.選取ID號為17、34、49和50號的第五代移植瘤模型，每例均隨機(jī)分為4組給予不同處理：生理鹽水、泰素(紫杉醇注射液)、卡鉑和順鉑。在實(shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)各

4、組平均移植瘤體積繪制生長曲線，計(jì)算腫瘤相對增殖率(T/C×100％，T為給藥組移植瘤體積的平均值，為對照組移植瘤體積的平均值)，觀察藥物的抑瘤效果，并與臨床治療效果相比較。
　　3.隨機(jī)選取12例第五代移植瘤凍存組織。選用AgilentSureSelect靶向序列富集捕獲法制備樣本文庫，借助IlluminaSolexaHiSeq2000測序平臺進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心的參考基因組build37.3進(jìn)行比對，確

5、定突變位點(diǎn)，結(jié)合HMGD(humanmutationgenedatabase)專業(yè)版(professionversion)和BIC(breastcallcerinfomaationcore)數(shù)據(jù)庫所公布的基因突變信息確定檢測到的突變是否為SNPs(SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs，單核昔酸多態(tài)性)以及是否是新的突變。
　　結(jié)果：
　　1.依據(jù)原代人卵巢癌組織裸鼠移植瘤接種成功標(biāo)準(zhǔn)，原代接種

6、成瘤率為53.13％(34/64)，再次傳代成功率：為94.12％(32/34)。人卵巢癌組織接種到裸鼠體內(nèi)后到第一次傳代時(shí)間間隔以2-3m為多，隨后的鼠間傳代時(shí)間間隔多數(shù)為3～8w，少數(shù)為2w左右。所有裸鼠皮下移植瘤模型均沒有腹水形成，且移植瘤的轉(zhuǎn)移能力較弱。只有少數(shù)腫瘤具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，接種后很快出現(xiàn)肝和脾轉(zhuǎn)移，但此種轉(zhuǎn)移能力隨傳代次數(shù)的增加而減弱。與人卵巢癌細(xì)胞系移植瘤相比，卵巢癌組織移植瘤與人原發(fā)瘤組織結(jié)構(gòu)更相似。
　　

7、2.不同F(xiàn)IGO分期的人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的成瘤率無顯著性差別(x2=3.022：P=0.388)；4例粘液腺癌成瘤率為零，其它不同組織學(xué)類型之間成瘤率亦無顯著差異(x2=0.997；P=0.802)。Ⅲ/Ⅳ期漿液性腺癌較Ⅰ/Ⅱ期漿液性腺癌在裸鼠體內(nèi)更易成瘤(P=0.018)，早期和晚期非漿液性腺癌的成瘤率無顯著差別。而對于Ⅰ/Ⅱ期卵巢癌來說，非漿液性腺癌(子宮內(nèi)模樣癌、透明細(xì)胞癌和低分化癌)則較漿液性腺癌更易成瘤(P=0.044)。

8、
　　3.各例泰素組、卡鉑組和順鉑組相對于空白對照組的T/C值如下：ID17號分別為44.93％、27.1％、11.77%；ID34號分別為65.15％、57.81％、30.67％；ID49號分別為49.50％、28.97％、6.79％；ID50號分別為68.97％、16.64％、34.02％。三種藥物對這4例人卵巢癌移植瘤均表現(xiàn)出顯著的抑瘤效果(P值均<0.01)，與臨床患者初始化療療效相似。
　　4.12例卵巢癌移植瘤組

9、織均發(fā)生了多個(gè)基因的點(diǎn)突變，一部分突變基因編碼蛋白為EGFR相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的上下游分子，如EGFR、KRAS、PIK3CA、AKT1、mTOR等。EGFR合并KRAS突變者5例、合并PIK3CA突變者3例、合并AKT1突變者2例、合并mTOR突變者2例。12例標(biāo)本中具有BRCA1和BRCA2突變者分別為7例和12例，其中合并TP53突變者分別為6例和10例，合并PARP1突變者分別為5例和10例。BRCA1、BRCA2和TP53基因

10、以多位點(diǎn)突變多見，而EGFR、KRAS、AKT1、PIK3CA、mTOR、PTEN及PARP1基因常表現(xiàn)為單一位點(diǎn)突變。12例移植瘤組織中CTNNB1和BRAF基因型均為野生型。通過檢索HMGD專業(yè)版和BIC數(shù)據(jù)庫，證實(shí)下述點(diǎn)突變?yōu)橹虏⊥蛔儯篍GFR的p.R521K突變，PARP1的p.V762A和p.K940R突變，BRCA1的p.W353Stop、p.P871L、p.E1038G、p.K1183R、p.S1613G、p.R1751S

11、top突變，BRCA2的p.N372H、p.H523R、p.13412V、p.A2466V突變，TP53的p.R72P、p.R273C、p.R175H、p.C141Y突變，上述突變中除BRCA2的p.H523R和TP53的p.C141Y兩個(gè)突變外，其余突變均已被證實(shí)為SNPs。
　　結(jié)論：
　　1.本研究建立的34例第一代裸鼠荷人卵巢癌移植瘤模型為今后進(jìn)一步深入研究卵巢癌創(chuàng)建了一個(gè)很好的研究平臺，但移植瘤可出現(xiàn)某些生物學(xué)行為