IP6對裸鼠上皮性卵巢癌移植瘤的影響.pdf

1、目的：卵巢癌是最常見的三大婦科惡性腫瘤之一，因為在解剖結(jié)構(gòu)上卵巢接近于盆腔最深部，早期的病變不易被察覺，而一旦出現(xiàn)了臨床癥狀，已多屬晚期。其中上皮性卵巢癌比例最高，達90％，近年來，隨著醫(yī)學的進步，盡管在全面腫瘤細胞減滅術(shù)聯(lián)合化療方面醫(yī)療技術(shù)較前有了很大的提高，使得卵巢生殖細胞腫瘤等類別生存率較前有了大幅提高，但上皮性癌的5年生存率卻未見明顯改善，仍停留在20%～30%，一直處于死亡率最高、預后最差的婦科惡性腫瘤的首位。目前，仍以鉑類為

2、基礎(chǔ)的聯(lián)合化療作為手術(shù)治療卵巢癌的主要輔助方法，但是化療藥物在心理及生理上給患者所帶來的一系列不良反應，一定程度上影響了癌癥的預后。因此尋找一種既可以降低毒性而又能提高療效的治療方法至關(guān)重要。近年來，科學家在對膳食纖維的研究過程中發(fā)現(xiàn)了一種物質(zhì)----肌醇六磷酸對于腫瘤有著很大的防治作用。美國馬里蘭大學的Abulkalam M. Shamsuddin博士與美國國家癌癥研究院的研究員們經(jīng)過多年努力，發(fā)現(xiàn)IP6具有防治多種疾病的功效。它能抑

3、制腫瘤細胞生長，減小癌灶體積；抗氧化，抑制并殺死自由基；防止生成腎結(jié)石；降低血脂濃度；保護心肌細胞免于心臟病發(fā)造成猝死；防止動脈發(fā)生硬化等。大量文獻報道，IP6可以通過調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導通路，或促進或抑制某些基因及蛋白的表達來發(fā)揮抗癌作用。但是IP6須與肌醇結(jié)合后，才可達到其最佳療效，因IP6與肌醇作用可以產(chǎn)生IP3，從而進一步發(fā)揮抗腫瘤作用。目前已有其對大腸癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等抑瘤作用的動物實驗的相關(guān)研究及報道，并取得了

4、顯著療效。但 IP6聯(lián)合肌醇能否在卵巢癌的治療中發(fā)揮作用，目前國內(nèi)外并未見相關(guān)報道，對此我們尚不清楚。本課題研究的主要目的就是通過觀察IP6聯(lián)合肌醇及其與順鉑聯(lián)用對人上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的影響，進一步分析IP6聯(lián)合肌醇對上皮性卵巢癌生長的抑制作用及其對凋亡相關(guān)蛋白 Bax及基因miRNA-21表達的影響，探討IP6聯(lián)合肌醇誘導上皮性卵巢癌凋亡的作用機理。
　　方法：⑴細胞培養(yǎng)：運用常規(guī)細胞培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)人上皮性卵巢癌細胞株S

5、KOV3，用來建立裸鼠皮下移植瘤模型。⑵裸鼠皮下移植瘤模型的建立及實驗分組：選取4-6周齡，重16-18g的BALB/c Nude雌性裸小鼠，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中備用。選取對數(shù)生長期的SKOV3細胞，消化，制成單細胞懸液，濃度大約為2.5×107個/ml，于無菌環(huán)境中接種在裸鼠皮下，每只裸鼠接種0.2ml細胞懸液（約合細胞數(shù)5×106個/只）（Fig.1）。接種5天后，選取移植瘤生長良好，直徑在3-5mm的裸鼠進行隨機分組（Fig.2）

6、，每組均設(shè)六只，分別為對照組，IP6+肌醇組，順鉑組及IP6+肌醇聯(lián)合順鉑組（聯(lián)合用藥組）。⑶實驗用藥的制備：實驗所需的所有藥物均用0.9%的氯化鈉溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。⑷給藥方法：IP6+肌醇組按照300mg/kg的濃度予以灌胃，每天一次，連續(xù)28天；順鉑組予以3mg/kg/d腹腔注射，連續(xù)7天；對照組每天分別予以同實驗組相同劑量的生理鹽水灌胃及腹腔注射；聯(lián)合用藥組則為IP6+肌醇300mg/kg灌胃,同時予以3mg/kg/d順鉑腹腔注射。

7、⑸裸鼠重量及移植瘤重量及體積的測量：實驗開始每天觀察裸鼠一般狀況，包括精神狀態(tài)、進食水及排便情況等，分別于用藥前及用藥后每周稱量裸鼠的重量并測量皮下移植瘤的最長徑線（a）及最短徑線（b），單位為mm，并按照公式 V（mm3）=πab2/6計算移植瘤的體積。于停藥后24小時終止觀察，用脫頸法處死裸鼠，剝?nèi)∑は铝鼋M織，稱重，并計算腫瘤抑制率 IR（%）=（1-治療組腫瘤平均體積/對照組腫瘤平均體積）×100%。⑹免疫組織化學染色檢測裸鼠皮下

8、移植瘤組織中 Bax蛋白的表達情況：取經(jīng)4%多聚甲醛固定的移植瘤組織（小于0.5cm×0.5cm×0.1cm）進行免疫組織化學染色，研究移植瘤組織中促凋亡蛋白 Bax的表達。⑺RT-PCR技術(shù)檢測移植瘤組織中miRNA-21的表達：取保存于-80℃冰箱未經(jīng)任何試劑處理的移植瘤組織，用 RT-PCR技術(shù)檢測其中miRNA-21的表達。⑻統(tǒng)計學方法：采用 SPSS13.0統(tǒng)計學軟件處理實驗數(shù)據(jù)。重復測量數(shù)據(jù)用重復測量方差分析，多樣本均數(shù)間比

9、較采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)間比較用t檢驗，實驗結(jié)果均以?x±S表示，等級資料采用K-W-H秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：①細胞培養(yǎng)過程瘤細胞生長狀態(tài)良好，取對數(shù)生長期細胞成功建立裸鼠皮下移植瘤模型。實驗進行中各組裸鼠的一般狀況，主要為精神狀態(tài)，用藥開始各組均較用藥前精神變差，但隨著用藥時間的延長，除順鉑組外均較用藥開始時有所好轉(zhuǎn)，實驗結(jié)束時各組由好變差依次為：對照組、IP6+肌醇組、聯(lián)合用藥組、順鉑

10、組。順鉑組及聯(lián)合用藥組在實驗開始時體重有所下降，但隨著給藥時間的延長，最終各組的裸鼠體重較前均有所增長，順鉑組較對照組增長緩慢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其余兩組與對照組無明顯差異。移植瘤體積各組亦是逐漸增長，各治療組體積均明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，且聯(lián)合用藥組體積明顯小于兩單獨用藥組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。實驗第29天測得移植瘤重量，各治療組均小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，且聯(lián)合用藥組瘤重明顯小于兩單獨用藥

11、組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。②移植瘤組織中Bax蛋白的表達情況：IP6+肌醇組、順鉑組及聯(lián)合用藥組移植瘤組織中Bax蛋白表達量均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義且聯(lián)合用藥組明顯高于IP6+肌醇組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而聯(lián)合用藥組與順鉑組間無明顯差異。③移植瘤組織中miRNA-21的表達情況：IP6+肌醇組及聯(lián)合用藥組移植瘤組織中miRNA-21表達量均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而順鉑組與對照組

12、相比無明顯差異。
　　結(jié)論：⑴IP6+肌醇組移植瘤的體積及重量小于對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義，說明 IP6+肌醇對上皮性卵巢癌具有抑制作用。并且聯(lián)合用藥組瘤組織的體積及重量均明顯小于順鉑組，說明二者具有協(xié)同的抗癌作用。⑵IP6+肌醇組及聯(lián)合用藥組對裸鼠精神狀態(tài)等一般情況以及對裸鼠體重的影響均小于順鉑組，表明IP6具有低毒副作用的特點，且聯(lián)合用藥能減輕化療副反應。⑶IP6+肌醇組、順鉑組及聯(lián)合用藥組移植瘤組織中Bax蛋白表達均高于