不同化療模式對(duì)卵巢癌裸鼠移植瘤中CD133表達(dá)的影響.pdf

1、卵巢上皮性癌（epithelial ovarian cancer，EOC）（以下簡稱為卵巢癌）是惡性腫瘤的第五大殺手，在婦科惡性腫瘤中死亡率居于首位[1]。標(biāo)準(zhǔn)的治療模式是徹底的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)合并鉑類為基礎(chǔ)的化療方案，但較高的耐藥性和不可避免的復(fù)發(fā)對(duì)傳統(tǒng)的最大耐受劑量間斷化療的模式，即MTD(maximum tolerated dose)模式發(fā)出挑戰(zhàn)[2]。而我們首先要做的是尋找腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)的根源。
　　近年來，研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤

2、的生長、轉(zhuǎn)移、化療耐藥和復(fù)發(fā)與腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)密切相關(guān)。在實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)方面，目前CSC的定義:可自我更新或再生的部分惡性細(xì)胞，可成功地異種移植并呈現(xiàn)與原腫瘤相同的具有異質(zhì)性的細(xì)胞表面標(biāo)志物或表型[3]。通常情況下化療能夠殺滅大多數(shù)增殖狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞，殘存CSCs能夠充填原來的空缺，形成新的瘤灶[4]。然而CSCs的子細(xì)胞也可遺傳CSCs的耐藥性特征，導(dǎo)致復(fù)發(fā)癌的化療低反應(yīng)。研究證實(shí)CSCs的數(shù)目與腫瘤

3、難治性成正比[5]。一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明MTD化療模式能富集CSCs[6]，為復(fù)發(fā)埋下隱患。因此，我們推測(cè)，減少殘存腫瘤中的CSCs，使原有的無分化潛能的腫瘤細(xì)胞處于主要地位，能夠有效地保持化療的敏感性，可能成為抵抗耐藥、降低復(fù)發(fā)率、改善預(yù)后的突破口。
　　低劑量持續(xù)化療(low-dose metronomic chemotherapy，LDM)作為一種新的化療模式于2000年由Browder等[7]首次提出并得到關(guān)注。胰腺癌、腦

4、膠質(zhì)瘤等異體移植瘤實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LDM化療后腫瘤中CSCs比率減少[8]。因此，LDM為基礎(chǔ)的化療模式可能對(duì)CSCs針對(duì)性治療更有效，有望為臨床卵巢癌治療提供新思路。
　　目的:
　　1 CSCs是導(dǎo)致化療后腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)的根源。本研究通過對(duì)裸鼠荷人卵巢癌SKOV3模型模擬進(jìn)行順鉑MTD及LDM模式化療，檢測(cè)不同化療模式對(duì)卵巢上皮性癌CSCs樣細(xì)胞的影響，以期為臨床治療提供新思路。
　　2本研究應(yīng)用CD133單克隆抗體進(jìn)行

5、細(xì)胞分選，并測(cè)定CD133陽性細(xì)胞的干細(xì)胞特性，進(jìn)而探討CD133作為卵巢癌CSCs標(biāo)記物的可行性。
　　方法:
　　1建立裸鼠異種移植瘤模型并進(jìn)行不同模式化療，定時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤生長情況及化療副反應(yīng)。
　　將卵巢上皮性癌SKOV3細(xì)胞1×107個(gè)，0.2 ml無血清培養(yǎng)基重懸，接種于16-18 g雌性裸鼠右側(cè)的大腿皮下，建立皮下異種移植瘤模型。2-3周后，當(dāng)移植瘤體積達(dá)150-200mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為三組即MTD組、

6、LDM組、對(duì)照組。MTD組給予順鉑3 mg/kg腹腔注射，3天為1周期，共6個(gè)周期;LDM組1 mg/kg連續(xù)化療18天;對(duì)照組給予等量生理鹽水。
　　每天腹腔注射前稱重裸鼠，每3天測(cè)量并記錄移植瘤的體積、食量，每6天抽取尾靜脈血檢測(cè)白細(xì)胞。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過程中，密切觀察化療對(duì)裸鼠的副反應(yīng)，包括體重的下降、食量減少、白細(xì)胞減少情況、行為和飲食的變化以及皮膚顏色的改變。
　　2流式細(xì)胞分選術(shù)分離并獲得CD133陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞。

7、
　　化療結(jié)束后3-7天，獲得三組腫瘤原代細(xì)胞。采用CD133熒光抗體標(biāo)記后細(xì)胞表現(xiàn)出不同的熒光強(qiáng)度，經(jīng)過流式細(xì)胞分選術(shù)分離獲得兩群細(xì)胞，即:熒光較強(qiáng)的細(xì)胞群（定義為CD133陽性細(xì)胞）和熒光相對(duì)較弱的細(xì)胞群（CD133陰性細(xì)胞）。
　　3測(cè)定CD133陽性細(xì)胞的部分CSCs樣特性。
　　3.1體外克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察分選所得CD133陽性及CD133陰性細(xì)胞克隆形成率。
　　由于流式細(xì)胞分選后所得CD133陽性細(xì)胞

8、數(shù)目較少，且一部分在實(shí)驗(yàn)中受損失去活性，本實(shí)驗(yàn)將三組細(xì)胞所得CD133陽性細(xì)胞混合培養(yǎng)，3天后細(xì)胞換液并選取活性好的貼壁細(xì)胞進(jìn)行體外克隆形成實(shí)驗(yàn)，CD133陰性細(xì)胞給予相同處理。兩種細(xì)胞同時(shí)接種于6孔板，每種細(xì)胞3個(gè)孔，待出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)3次，比較兩種細(xì)胞克隆形成情況，并計(jì)算各自的克隆形成率。
　　3.2 Western blot方法檢測(cè)CD133陽性細(xì)胞與CD133陰性細(xì)胞中乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白(BCRP)的表

9、達(dá)。
　　應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)蛋白，細(xì)胞數(shù)目至少達(dá)105，而流式細(xì)胞分選所得CD133陽性細(xì)胞較少，不足以分組進(jìn)行蛋白測(cè)定，因此將3組腫瘤細(xì)胞分選后所得CD133陽性細(xì)胞直接混合后提取蛋白進(jìn)行BCRP和下面所述的Ki-67蛋白的測(cè)定。CD133陰性細(xì)胞同樣混合后實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　3.3 Western blot方法檢測(cè)CD133陽性細(xì)胞與CD133陰性細(xì)胞中的Ki-67蛋白的表達(dá)。
　　4統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊性檢驗(yàn)，三組以上采用方差分析，組間差異采用LSD法，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)P＞0.05時(shí)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1 LDM較MTD模式化療更明顯地抑制腫瘤生長，且副反應(yīng)可耐受。
　　將SKOV3細(xì)胞1×107個(gè)接種于30只雌性裸鼠右側(cè)大腿皮下，成瘤率為10

11、0％，2-3周后當(dāng)移植瘤體積150-200mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為三組:MTD組、LDM組、對(duì)照組，移植瘤平均體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。化療結(jié)束時(shí)，統(tǒng)計(jì)三組移植瘤平均體積分別為564.72±43.89 mm3、382.25±28.09 mm3、782.01±34.24mm3，兩兩之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)公式，抑瘤率=（對(duì)照組移植瘤平均體積-實(shí)驗(yàn)組移植瘤平均體積）/對(duì)照組移植瘤平均體積×100％,計(jì)算抑瘤率:MTD組抑瘤率

12、為27.78％，LDM組抑瘤率為51.12％。表明LDM化療較MTD模式對(duì)于腫瘤生長的抑制更有效。
　　化療過程中，MTD組和LDM組與對(duì)照組比較，裸鼠均出現(xiàn)體重減輕(P＜0.05)、食量減少(P＜0.05)、白細(xì)胞減少(P＜0.05)、精神萎靡等副反應(yīng)，但根據(jù)化療副反應(yīng)的分級(jí)，化療副反應(yīng)屬于Ⅰ級(jí)，表明裸鼠能夠一定程度的耐受化療。LDM組較MTD組化療副反應(yīng)未發(fā)現(xiàn)明顯差異，上述指標(biāo)在兩組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。<

13、br>　　2 MTD化療能富集腫瘤中的CD133陽性細(xì)胞，而LDM化療則降低其在腫瘤中的表達(dá)。
　　流式細(xì)胞分選術(shù)檢測(cè)CD133陽性細(xì)胞在LDM組腫瘤中所占比率（0.247％±0.021％），明顯低于對(duì)照組（0.413％±0.021％，P=0.001）。而MTD組CD133陽性細(xì)胞比率為（1.463％±0.208％）較對(duì)照組顯著升高(P=0.000)。結(jié)果表明，傳統(tǒng)的MTD化療能富集CD133陽性細(xì)胞，而LDM模式則顯著降低其表達(dá)

14、。
　　3 CD133陽性細(xì)胞表現(xiàn)出部分CSCs樣特性。
　　3.1 CD133陽性細(xì)胞較CD133陰性細(xì)胞顯示較強(qiáng)的克隆形成能力。
　　應(yīng)用體外平板克隆實(shí)驗(yàn)比較CD133陽性細(xì)胞和CD133陰性細(xì)胞的克隆形成能力:將兩種細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，接種至6孔板中，每種細(xì)胞3孔，每孔接種500個(gè)細(xì)胞，2-3周后出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng)，鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)＞30個(gè)的克隆球。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。
　　克隆形成率(％)=克隆數(shù)/

15、接種細(xì)胞數(shù)×100％，統(tǒng)計(jì)CD133陽性細(xì)胞的克隆形成率(49.8％±2.03％)顯著高于CD133陰性細(xì)胞（3.31％±0.61％，P=0.00）。結(jié)果表明，CD133陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的克隆形成能力，這也是CSC鑒定的一個(gè)重要條件。
　　3.2 CD133陽性細(xì)胞較CD133陰性細(xì)胞耐藥性強(qiáng)。
　　耐藥蛋白BCRP能獨(dú)立或聯(lián)合經(jīng)典耐藥蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多重耐藥蛋白(MRP)介導(dǎo)多藥耐受。Western blot結(jié)

16、果顯示，耐藥蛋白BCRP在CD133陽性細(xì)胞中表達(dá)（0.677±0.032）顯著高于CD133陰性細(xì)胞(0.228±0.018, P＜0.05)。
　　3.3 CD133陽性細(xì)胞增殖活性較CD133陰性細(xì)胞差。
　　Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，在細(xì)胞增殖中不可或缺，只表達(dá)于增生的細(xì)胞，靜止的細(xì)胞中不表達(dá)，通過檢測(cè)Ki-67蛋白了解惡性腫瘤的細(xì)胞增殖活性。
　　Western blot檢測(cè)Ki-67蛋白在兩種細(xì)

17、胞中的表達(dá)結(jié)果:CD133陽性細(xì)胞（0.215±0.001）vs陰性細(xì)胞（0.739±0.009），P＜0.05。提示CD133陽性細(xì)胞較陰性細(xì)胞增殖活性差，符合CSCs的休眠的存在狀態(tài)的特性。
　　結(jié)論:
　　1順鉑LDM模式化療較傳統(tǒng)MTD化療能顯著減緩裸鼠移植瘤的生長，并能耐受化療副反應(yīng)。
　　2 CD133陽性細(xì)胞表現(xiàn)出部分的CSC樣特性。
　　3順鉑LDM模式化療可降低卵巢癌移植瘤中CSC樣細(xì)胞的比率，