荷人卵巢癌裸鼠循環(huán)無細(xì)胞DNA的來源及其與瘤負(fù)荷、凋亡的關(guān)系.pdf

1、目的：循環(huán)無細(xì)胞DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）是存在于體液中的碎裂的核酸片段。本實(shí)驗(yàn)利用人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3建立荷人卵巢癌裸鼠移植模型。采用半定量PCR的方法，檢測(cè)荷人卵巢癌裸鼠血清和腹水中無細(xì)胞DNA的含量，并與腫瘤的重量、凋亡率進(jìn)行對(duì)比，研究人卵巢癌移植瘤裸鼠模型血清及腹水中cfDNA的血流動(dòng)力學(xué)改變，探討cfDNA在卵巢上皮性癌臨床診斷及病情監(jiān)測(cè)中的意義。通過檢測(cè)荷瘤裸鼠經(jīng)化療前后血清

2、cfDNA水平的變化規(guī)律，并與細(xì)胞凋亡進(jìn)行對(duì)比，從而為cfDNA是否可作為無創(chuàng)性的卵巢癌患者病情監(jiān)測(cè)及療效觀察的生物學(xué)指標(biāo)提供理論依據(jù)。
　　 方法：將人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3種植于6-8周齡雌性裸鼠的皮下及腹腔中，觀察裸鼠成瘤和腫瘤生長(zhǎng)情況。分別于14天（荷瘤1組），21天（荷瘤2組）和30天（荷瘤3組）取皮下種植瘤模型血清及腫瘤，14天取腹水種植瘤模型血清和腹水。皮下種植瘤模型化療組在種植后第30天用順鉑3mg/kg化療1次

3、，于化療后第1天（化療1組），第3天（化療2組）和第10天（化療3組）取血清及腫瘤。用QIAGEN微量提取試劑盒提取血清及腹水中游離的DNA片段。我們針對(duì)臨床常用的診斷和監(jiān)測(cè)指標(biāo)血清CA125蛋白的基因序列設(shè)計(jì)了擴(kuò)增產(chǎn)物為101bp、261bp、189bp和336bp大小的四組DNA片段引物。用半定量PCR方法擴(kuò)增β-actin，CA125-DNA片段和ALU重復(fù)片段。腫瘤相關(guān)cfDNA的量用ALU247/ALU115來表示，CA125

4、-cfDNA的相對(duì)水平用CA125 DNA/β-actin來表示。檢測(cè)荷瘤1、2、3組；化療1、2、3組和腹水組的血清及腹水組腹水中cfDNA的含量，并與相應(yīng)的腫瘤重量進(jìn)行對(duì)比。用TUNNEL法檢測(cè)荷瘤3組及化療1、2、3組組織細(xì)胞的原位凋亡，將其凋亡率與相應(yīng)的cfDNA含量進(jìn)行相關(guān)性分析。試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，單因素方差分析，和spearman相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)果：
　　

5、 1.各組基因片段在人卵巢癌裸鼠移植瘤模型血清及腹水中的表達(dá)情況
　　 在人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的血清及腹水中均能檢測(cè)到人類特有的基因片段β-actin、ALU115、ALU247以及CA125-cfDNA中的101bp片段。其中78例卵巢癌血清標(biāo)本中，有41例能檢測(cè)到CA125-cfDNA的261bp基因片段，189bp片段含量很少，336bp未能檢測(cè)，三個(gè)指標(biāo)相應(yīng)的β-actin均能檢測(cè)出來。故本實(shí)驗(yàn)所作數(shù)據(jù)分析中的CA1

6、25-cfDNA僅就101bp片段進(jìn)行比較和討論。3AO組（種植3A0細(xì)胞株后30天取材）與SKOV3瘤負(fù)荷3組（種瘤時(shí)間相同）血清中的腫瘤相關(guān)cfDNA的含量沒有顯著性差異（t=0.193，P>0.05），CA125-cfDNA的含量沒有顯著性差異（t=-1.423，P>0.05）。腹水組荷瘤裸鼠腹水中的腫瘤相關(guān)cfDNA的含量與血清中的含量相比沒有顯著性差異（t=1.412，P>0.05），腹水中的CA125-cfDNA的含量與血清

7、中的含量沒有顯著性差異（t=3.535，P>0.05）。（Table1）。
　　 2.各組人卵巢癌裸鼠移植瘤模型血清中cfDNA水平的變化情況及其與瘤負(fù)荷的關(guān)系
　　 分別于皮下種植SKOV3卵巢癌細(xì)胞株后14天（荷瘤1組），21天（荷瘤2組）和30天（荷瘤3組）取人卵巢癌裸鼠移植瘤模型血清中的CA125-cfDNA及腫瘤相關(guān)cfDNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中的CA125-cfDNA的表達(dá)各組間有差異（F=15.191，P<0.

8、05），荷瘤2組高于荷瘤1組，差異有顯著性（P<0.05），荷瘤3組高于荷瘤2組，差異有顯著性（P<0.05）。血清中的腫瘤相關(guān)cfDNA的表達(dá)各組間有差異（F=52.253，P<0.05），荷瘤2組高于荷瘤1組，差異有顯著性（P<0.05），荷瘤3組高于荷瘤2組，差異有顯著性（P<0.05）。（Table1）。SKOV3瘤負(fù)荷1、2、3組裸鼠血清中的CA125-cfDNA101bp片段及腫瘤相關(guān)cfDNA與腫瘤重量呈正相關(guān)（CA125

9、.cfDNA101bp片段的R=0.830，P<0.05腫瘤相關(guān)cfDNA的R=0.780，P<0.05）。（Table3，F(xiàn)ig8，F(xiàn)ig9）。
　　 3.血清cfDNA在化療前后的變化情況
　　 化療組荷瘤裸鼠血清CA125-cfDNA及腫瘤相關(guān)cfDNA的值在化療后第1天達(dá)最高水平，第3天有下降趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（CA125-cfDNA的P=0.932，腫瘤相關(guān)cfDNA的P=0.068，均>0.05）。在化

10、療第10天其值明顯低于化療前水平，差異有顯著性（CA125-cfDNA的P=0.047，腫瘤相關(guān)cfDNA的P=0.013，均<0.05）。（Table3）。
　　 4.化療前后血清cfDNA水平與腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系
　　 化療前后血清CA125-cfDNA及腫瘤相關(guān)cfDNA與腫瘤細(xì)胞的凋亡率呈正相關(guān)（CA125-cfDNA101 bp片段的R=0.742，P<0.05；腫瘤相關(guān)cfDNA的R=0.693，P<0.05