凍存卵巢移植中的ERS及FSH干預作用的研究.pdf

1、目的：
　　本實驗通過玻璃化凍存小鼠卵巢移植小鼠腎被膜下后，檢測不同時段卵巢中內質網應激（ERS）分子伴侶GRP78、凋亡相關蛋白CHOP、Caspase-12的表達水平，探討凍存移植過程中是否激活了卵巢內ERS，以及移植后卵巢早期發(fā)育中存在的卵泡丟失是否與ERS途徑介導的細胞凋亡相關聯(lián)，采用FSH干預，探究其干預效果。
　　方法：
　　4周齡C57BL/6J雌性間期小鼠，取其雙側卵巢，剝離外膜后縱向對切成兩半，隨機分

2、為新鮮組、空白組、TM組、保護劑滲透組、凍存組、TUDCA干預凍存組、FSH干預凍存組。各組培養(yǎng)后行腎被膜下移植術，術后監(jiān)測受體鼠動情周期的恢復情況，并且在術后2天、4天、6天、28天取材，制作石蠟切片。HE染色觀察，移植后28天每組卵巢卵泡的形態(tài)，并做正常卵泡計數(shù)。并且采用免疫組織化學法檢測移植后2天，4天，6天分組中內質網應激伴侶分子GRP78、凋亡相關蛋白CHOP、Caspase-12蛋白表達，Western blotting技術

3、檢測GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達水平。TUNEL法檢測各組卵巢內細胞凋亡水平。移植后28天取小鼠血清檢測血清中E2和FSH含量。
　　結果：
　?。?）常規(guī)玻璃化卵巢凍存移植后，各組卵泡計數(shù)結果顯示TM組、凍存組和保護劑滲透組卵泡計數(shù)明顯低于空白組（P<0.05）；動情周期恢復情況顯示TM組、凍存組和保護劑滲透組動情周期的恢復時間明顯比空白組延長（P<0.05），凍存組恢復時間最長（P<0.05）；激素

4、水平測定結果顯示：各組E2濃度無明顯差異（P>0.05）。
　　（2）凍存過程加入FSH干預后，F(xiàn)SH干預凍存組、TUDCA干預凍存組卵泡計數(shù)明顯高于單純凍存組（P<0.05），其動情周期恢復時間也明顯比凍存組縮短（P<0.05）；激素水平測定顯示：FSH干預凍存組、TUDCA干預凍存組E2激素含量高于單純凍存組(P<0.05)；
　?。?）凋亡檢測結果顯示：常規(guī)玻璃化凍存卵巢移植后2天、4天凋亡較強，6天減弱。移植后的第2

5、天、4天，凍存組凋亡明顯強于其余各組（P<0.05）；加入FSH干預凍存后，相同時間點，F(xiàn)SH干預凍存組、TUDCA干預凍存組的卵泡凋亡明顯減弱（P<0.05），且FSH干預凍存組凋亡程度明顯低于TUDCA干預凍存組（P<0.05）；
　?。?）常規(guī)玻璃化凍存移植后檢測各組ERS標志蛋白，免疫組織化學結果顯示GRP78蛋白主要表達于卵泡的顆粒細胞胞漿中，其表達在移植后的第2天達到高峰，4天開始減弱。移植后第2天、第4天，凍存組、保

6、護劑誘導組、TM組GRP78蛋白的表達明顯高于空白組（P<0.05），Western blotting蛋白定量結果顯示了相同的趨勢；CHOP蛋白主要定位于卵母細胞和顆粒細胞胞漿中，在移植后的第2天，第4天表達高峰，第6天減弱。移植后第2天凍存組、保護劑滲透組、TM誘導組的CHOP表達明顯高于空白組（P<0.05）；Caspase-12蛋白主要定位于顆粒細胞及間質細胞胞胞漿中，在移植后的第2天，第4天表達達高峰，第6天減弱。移植后第2天，

7、凍存組、保護劑滲透組、TM組Caspase-12明顯高于空白組（P<0.05）；
　?。?）常規(guī)玻璃化凍存過程中加入FSH干預后，移植后第2，4天，Western blotting蛋白定量結果顯示FSH干預凍存組和TUDCA干預凍存組GRP78蛋白的表達量明顯低于凍存組（P<0.05），但仍高于空白組（P<0.05）；TUDCA干預組CHOP和Caspase-12蛋白表達明顯低于凍存組（P<0.05），但FSH干預組與凍存組相比沒

8、有明顯差異；
　　結論：
　　1.凍存卵巢移植后的生長早期發(fā)生了內質網應激，在移植后的第2天最強。發(fā)育的第4天，內質網應激保護途徑已經轉向了凋亡途徑。移植后的卵泡發(fā)育過程中的卵泡丟失跟內質網應激相關。
　　2.FSH的干預可以提高凍存移植卵巢的正常卵泡數(shù)，而且縮短了受體鼠動情周期的恢復時間，有利于其E2激素水平的恢復；FSH的干預可以減少卵巢凍存移植過程中的卵泡凋亡；通過對內質網應激標志分子的檢測結果顯示，F(xiàn)SH減弱內