人羊膜上皮細胞凍存前后生物學特性比較及其對脂多糖致肺損傷干預作用的研究.pdf

1、目的：
　　1、液氮深低溫保存人羊膜上皮細胞（human Amniotic Epithelial Cells，hAECs）是否會對其干細胞活性產(chǎn)生影響，相關報道較少見。本研究從細胞形態(tài)學、細胞生長狀況、細胞表面干細胞標志物及干細胞基因表達、細胞體外成骨細胞、成脂肪細胞多向誘導分化四個方面，來觀察 hAECs凍存前后的生物學活性和干細胞特性，以研究液氮深低溫保存hAECs的可靠性。
　　2、膿毒血癥仍然是導致急性肺損傷（acu

2、te lung injury，ALI）最常見的原因，目前尚缺乏十分有效的治療手段。本研究通過檢測肺組織病理學切片、肺組織和血清中細胞因子的變化，來觀察 hAECs對內(nèi)毒素性肺損傷的干預作用及其可能機制，以探討人羊膜上皮細胞治療急性肺損傷的可行性。
　　方法：
　　1、取健康產(chǎn)婦足月剖宮產(chǎn)后胎盤的羊膜組織，采用多次胰酶消化法獲取hAECs，培養(yǎng)過程中經(jīng)多次差別消化法逐步純化hAECs。調(diào)整純化的第2代（P2）細胞密度至5×10

3、6/mL，向細胞中緩慢加入新鮮配制的二甲基亞砜（DMSO）凍存液。將凍存管置于程序降溫儀中，待溫度降至-100℃后迅速移入液氮罐中保存。1個月后對細胞進行復蘇培養(yǎng)，觀察凍存前后 hAECs的形態(tài)變化及增殖情況；并用流式細胞分析儀檢測細胞表面標記物（CD29、CD73、CD166、CD44、CD90、HLA-ABC、CD34）；用RT-PCR法檢測Oct-4及 Nanog干細胞基因表達；同時在體外誘導hAECs向脂肪細胞、成骨細胞分化。數(shù)

4、據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差（x?s）表示，采用獨立樣本t檢驗法分析兩組間的差異。
　　2、向新生SD大鼠腹腔內(nèi)注射大腸桿菌內(nèi)毒素溶液20μL/g(5mg/kg)，制備脂多糖致急性肺損傷的動物模型。造模后2h經(jīng)氣管滴入CM-Dil熒光標記好的P2代hAECs。動物隨機分組如下：（A）正常組（n=5）；（B）模型組（LPS）（n=5）：腹腔內(nèi)注射LPS5mg/kg；（C）細胞組（n=5）：腹腔內(nèi)

5、注射LPS5mg/kg+氣管內(nèi)滴注hAECs（5×105個cells/40μL）；（D）對照組（n=5）：腹腔內(nèi)注射LPS5mg/kg+氣管內(nèi)滴注40μLPBS液。分別在輸注細胞24h、72h后，處死動物收取標本，每組每個時間點各5只大鼠。取肺組織標本固定，HE染色后觀察肺損傷程度，測量肺損傷病理評分、肺泡間隔的厚度，測量肺干濕比（D/W）。用ELISA免疫吸附法檢測肺組織丙二醛（MDA）濃度和超氧化物歧化酶（SOD）活性、同時檢測血清

6、中白介素10（IL-10）和白介素6（IL-6）的濃度。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差（x?s）表示，用單因素方差分析法分析組間差異。
　　結果：
　　1、hAECs凍存前后的形態(tài)學無明顯改變，均呈鋪路石樣膜狀生長。與凍存前細胞相比，凍存后hAECs傳代時所需的消化時間有所縮短（P<0.05），但細胞活率、傳代時間、培養(yǎng)代數(shù)無明顯改變。凍存前后細胞生長曲線均呈S型，凍存后細胞與凍存前細胞

7、的生長周期相比，細胞經(jīng)歷滯留期、對數(shù)期和平臺期的時間無明顯差異。
　　2、凍存后hAECs仍可以表達干細胞表面標記，CD73、CD29、CD166陽性率達90％以上，中度表達CD90、CD44，低表達I類白細胞抗原(HLA-ABC)，不表達造血干細胞標志CD34。RT-PCR法檢測Oct-4及 Nanog基因表達均呈陽性。體外誘導后，凍存前后的hAECs均可向成骨細胞、成脂肪細胞分化。
　　3、腹腔內(nèi)注射LPS后，肺組織可見

8、不同程度充血、血管內(nèi)皮損傷出血，部分肺泡萎陷不張，部分肺泡間隔增厚、破壞。模型組與正常組相比，肺損傷病理評分、肺泡間隔的厚度均有顯著增加（P<0.01）、肺干濕比減低（P=0.04）。檢測肺組織和血清中的生化指標發(fā)現(xiàn)， MDA濃度有所升高伴SOD活性減低，模型組與正常組比較，兩者的變化都尚未達到統(tǒng)計學意義（P>0.05）。模型組血清中促炎癥因子IL-6水平逐漸升高，抗炎因子IL-10的水平逐漸減低，與正常組相比， IL-6水平24h為1

9、.25±0.01（P=0.762），72h為1.61±0.29（P=0.006）；IL-10的水平24h為13.68±1.14（P=0.219），72h為12.49±0.40（P=0.005），兩種因子在血清中的濃度變化72h時差別具有統(tǒng)計學意義。
　　4、輸入hAECs細胞后，細胞組與對照組相比，24h和72h時肺損傷評分、肺泡間隔厚度均有顯著降低（P<0.01），差別具有統(tǒng)計學意義。細胞組中肺干濕比（D/W值）與對照組相比有所

10、升高，24h時P=0.046，差異具有統(tǒng)計學意義，72h時P=0.366差異無明顯統(tǒng)計學意義。細胞組氧化因子MDA的濃度在肺組織中逐漸減低，抗氧化因子SOD活性逐漸升高，與對照組對比，差別具有統(tǒng)計學意義。細胞組中促炎癥因子IL-6水平降低，抗炎因子IL-10水平升高，與對照組相比72h時P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1、凍存后的hAECs除細胞貼壁性有所下降外，細胞形態(tài)、細胞生長周期、細胞表面干細胞標記