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文檔簡介
1、背景:急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導致的急性、進行性呼吸衰竭,由于缺乏特異有效的治療方法,其病死率仍然高達36%-44%。肺部進行性纖維增殖的發(fā)生是影響ARDS患者搶救成功率及預后的主要因素。即便是幸存者,也會由于肺纖維化發(fā)生而遺留不同程度的肺功能損害和運動能力下降。因此,ARDS的肺纖維化進程及其發(fā)生機制是ARDS研究的重要
2、方向。機械通氣是ARDS患者重要的治療手段之一,機械通氣給予患者重要生命支持的同時,不適當?shù)臋C械通氣會引發(fā)或加重肺損傷。然而機械通氣對ARDS相關的纖維化發(fā)生的影響一直未被重視。過度的機械牽張會引起肺上皮損傷,持續(xù)的上皮損傷可以導致病理性修復甚至纖維化發(fā)生。同時越來越多研究表明肌成母纖維細胞作為調(diào)節(jié)肺纖維化進程的關鍵細胞,其主要激活方式是通過局部上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial to mesenchymal transition,EM
3、T)過程實現(xiàn)。因此本實驗以人肺上皮細胞為研究對象,通過體外試驗研究機械牽張對人肺上皮細胞EMT的影響及其可能機制,探討機械通氣在ARDS相關的肺間質(zhì)纖維化進程中的作用。
目的:研究不同條件的機械牽張對人肺上皮細胞BEAS-2B向間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用,從體外水平探討機械通氣在急性呼吸窘迫綜合癥相關肺纖維化中的作用及可能存在的機制。
方法:模擬氣管內(nèi)滴入鹽酸的ARDS動物模型方法,牽張前對體外培養(yǎng)的BEAS-2B細胞用0.1
4、N HCl進行預刺激(培養(yǎng)液PH=4.0)30min,同時用PBS處理作為對照。應用FX-5000細胞牽張加載系統(tǒng)對處理后細胞施加不同條件的牽張刺激:10%,20%牽張應力分別牽張24h,48h和72h,頻率0.33Hz。實驗分組:對照組;PBS+10%牽張組;PBS+20%牽張組;HCl組;HCl+10%牽張組;HCl+20%牽張組。相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化,采用RT-qPCR、Western blot和免疫熒光方法分別檢測E-c
5、adherin、Cytokeratin-8、α-SMA、Vimentin、TGF-β1、ACE2以及Midkine mRNA和蛋白的表達。應用Lipofectmine2000將Midkine siRNA轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞后施加20%牽張應力48h,Westem blot觀察沉默Midkine表達對上述各指標表達的影響。
結果:⑴BEAS-2B細胞受到20%牽張48h及72h均可觀察到EMT改變,表現(xiàn)為細胞形態(tài)由鵝卵圓形變?yōu)?/p>
6、長梭樣,細胞間隙明顯增寬;上皮標志物E-cadherin,Cytokeratin-8表達較對照組明顯下調(diào),α-SMA,Vimentin及TGF-β1表達上調(diào)(p<0.05);細胞予以10%牽張后其EMT相關指標變化不明顯,差異無統(tǒng)計學意義。⑵予以HCl預處理后行20%牽張在24h時出現(xiàn)上述改變;予HCl預處理后行10%牽張,牽張72h后可觀察到EMT改變。⑶BEAS-2B細胞受到20%牽張48h后Midkine表達出現(xiàn)上調(diào)。⑷沉默Mid
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