基于“疏通肺絡(luò)法”研究艾灸對(duì)肺纖維化大鼠上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化機(jī)制的影響.pdf

1、研究目的：
　　肺纖維化（pulmonary fibrosis,PF)是呼吸系統(tǒng)最嚴(yán)重的疾病之一,臨床上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難、喘息、氣短、咳嗽咯痰,以限制性通氣功能障礙,低氧血癥為主,最終導(dǎo)致呼吸衰竭。上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞（epithelial-mesenchymal transition,EMT）理論是近年國(guó)際研究器官纖維化的主要成果之一。因此本課題擬在前期研究成果的基礎(chǔ)之上,采用疏通肺絡(luò)治法,選取（肺俞、膏肓俞）艾灸（mox

2、ibustion）,觀察由博來(lái)霉素復(fù)制的經(jīng)典肺纖維化大鼠模型在艾灸治療療程中上皮細(xì)胞蛋白E-鈣黏蛋白（E-cadherin,E-cad）,間質(zhì)細(xì)胞蛋白α-平滑肌蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、波形蛋白（vimentin）的mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)改變,初步闡明疏通肺絡(luò)法調(diào)控肺纖維化EMT關(guān)鍵位點(diǎn)與調(diào)控規(guī)律。
　　方法：
　　8周齡健康SPF級(jí)大鼠81只,體重180士20g,雌雄各半。將大鼠隨機(jī)分組：

3、空白對(duì)照（C）組9只；模型（B）組：模型7天（B7）組9只、模型11天（B11）組9只、模型23天（B23）組9只、模型35天（B35)組9只；艾灸（M）組：艾灸11天(M11）組9只、艾灸23天（M23）組9只、艾灸35天（M35）組9只；陽(yáng)性對(duì)照（潑尼松,P）組9只。造模采用Thrall等方法氣管內(nèi)一次性注入博來(lái)霉素復(fù)制肺纖維化模型,空白對(duì)照組同樣按造模方法予以氣管內(nèi)一次性注射等體積的生理鹽水。各組造模均于第二天開(kāi)始治療及干預(yù),艾灸

4、組交替艾灸雙側(cè)肺俞、膏育俞；潑尼松組以潑尼松灌胃；空白組和所有模型組與艾灸組采取同樣的抓取固定,不給予任何治療。模型組第7、11、23、35天,分別選對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)組大鼠；艾灸組第11、23、35天（每療程后一天）,分別選取對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大鼠；潑尼松組、空白組于35天后全部選取。各組稱取體重,采取股動(dòng)脈放血處死大鼠,打開(kāi)胸腔,觀察肺大體顏色、體積、有無(wú)出血點(diǎn)、結(jié)節(jié)等。取左肺組于10％中性甲醛固定,再選取左肺上葉固定、包埋、切片行HE、Masso

5、n染色后,按照Szapie法進(jìn)行肺泡炎分級(jí)評(píng)分和肺纖維化分級(jí)評(píng)分。取右肺上葉組織用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（QPCR）檢測(cè)E-cadherin mRNA、α-SMA mRNA、vimentin mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所得數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有計(jì)量數(shù)據(jù)都用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示,采用多因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠一般情況觀察：

6、>　　空白對(duì)照組大鼠呼吸均勻平穩(wěn),毛發(fā)潤(rùn)澤光亮,反應(yīng)靈敏,大便成形,體重正常增長(zhǎng)；模型組大鼠呼吸急促,胸廓起伏增大加快,鼻部及爪甲呈青紫色,精神萎靡不振,弓背蜷縮,毛發(fā)稀疏無(wú)光澤,大便糖稀,體重明顯下降；治療后,艾灸組與模型組相比一般情況有較大的改善；陽(yáng)性對(duì)照組同艾灸組無(wú)明顯差異。
　　2.肺系數(shù)
　　模型組、艾灸組和陽(yáng)性對(duì)照組各組肺系數(shù)均顯著大于空白對(duì)照組(P<0.01)；模型組11d與艾灸組11d無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.0

7、5）,模型組23d肺系數(shù)較艾灸組23d、模型組35d肺系數(shù)較艾灸組35d均升高,有顯著性差異（P＜0.01）；模型組35d肺系數(shù)較陽(yáng)性對(duì)照組高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；艾灸35d組與陽(yáng)性對(duì)照組肺系數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.病理學(xué)觀察
　　3.1模型組：模型組第7、11d肺泡炎程度較空白對(duì)照組均顯著升高（P<0.01）,模型組7d肺纖維化程度與空白對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別,統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異（P>0.05）,模型組11

8、d肺纖維化明顯較空白對(duì)照組嚴(yán)重（P<0.01）；模型組第23、35d肺泡炎程度減輕但較空白對(duì)照組仍嚴(yán)重（P<0.05）,模型組23、35d肺纖維化程度較空白對(duì)照組嚴(yán)重,有顯著性差異（P<0.01）。
　　3.2艾灸組：艾灸組11d肺泡炎程度較空白對(duì)照組嚴(yán)重（P<0.01）,艾灸組23、35d肺泡炎程度有所減輕,較空白對(duì)照組仍有差異（P<0.05）；艾灸組11d較模型組11d肺泡炎癥有所減輕,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）,模型組23

9、與艾灸組23d無(wú)明顯差異（P＞0.05）,艾灸35d較模型35d肺泡炎明顯減輕有顯著性差異（P<0.01）；艾灸組11、23、35d肺纖維化程度較空白對(duì)照組嚴(yán)重（P<0.01）,艾灸組11、23d分別與模型組11、23d無(wú)明顯差異（P>0.05）,艾灸組35d較模型35d肺纖維化程度減輕,有顯著性差異（P<0.01）。
　　3.3陽(yáng)性對(duì)照組：陽(yáng)性對(duì)照組肺泡炎程度和肺纖維化較空白對(duì)照組嚴(yán)重,有顯著性差異（P<0.01）,陽(yáng)性對(duì)照組肺

10、泡炎癥程度與模型組35d、艾灸組35d均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組纖維化程度較模型組35d有所減輕,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）,陽(yáng)性對(duì)照組和艾灸組35d纖維化程度無(wú)明顯差異,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　4.各組肺組織蛋白mRNA的表達(dá)
　　4.1E-鈣黏蛋白mRNA表達(dá)的影響
　　與空白對(duì)照組相比,模型組、艾灸組、陽(yáng)性對(duì)照組E-cad的mRNA表達(dá)量均有不同程度的下降,以模型組35d最低；艾灸治

11、療干預(yù)后艾灸組E-cad的mRNA表達(dá)量其下降趨勢(shì)明顯比同期模型組緩慢,尤其是第35d與模型組同期相比,艾灸組35dE-cad mRNA表達(dá)量明顯增多,有顯著差異(P<0.01)；而陽(yáng)性對(duì)照組與模型組35d相比,陽(yáng)性對(duì)照組E-cad mRNA表達(dá)量增多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；
　　4.2α-平滑肌蛋白mRNA表達(dá)的影響
　　與空白對(duì)照組相比,模型組、艾灸組、陽(yáng)性對(duì)照組a-SMA的m RNA表達(dá)量均有不同程度的上升,以

12、模型組35d最高；艾灸治療干預(yù)后艾灸組a-SMA的mRNA表達(dá)量其上升勢(shì)明顯比同期模型組緩慢,第11天與模型組相比,艾灸組11dα-SAM mRNA表達(dá)量明顯減少,有顯著差異(P<0.01)；第35天與模型組相比,艾灸組35dα-SAM mRNA表達(dá)量有所減少,有差異(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組和模型組35d、艾灸組35d均無(wú)明顯差異,統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)意義(P>0.05)。
　　4.3波形蛋白mRNA表達(dá)的影響
　　與空白對(duì)照組相比

13、,模型組、艾灸組、陽(yáng)性對(duì)照組vimentin的mRNA表達(dá)量均有不同程度的上升,以模型組35d最高；艾灸治療干預(yù)后艾灸組vimentin的mRNA表達(dá)量其上升勢(shì)明顯比同期模型組緩慢,第23天與模型組相比,艾灸組23d vimentin mRNA表達(dá)量明顯減少,有顯著差異(P<0.01)；第35天與模型組相比,艾灸組35d vimentin mRNA表達(dá)量有所減少,有差異(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組和模型組35d、艾灸組35d均無(wú)明顯差異

14、,統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一次性氣管灌注博萊霉素所獲得大鼠肺纖維化模型,其各時(shí)間點(diǎn)的病理形態(tài)改變與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)由博來(lái)霉素復(fù)制的經(jīng)典肺纖維化大鼠模型是成功的。
　　(2)艾灸對(duì)肺纖維化發(fā)展各個(gè)階段肺組織病理形態(tài)（肺泡炎和肺纖維化）有改善作用,說(shuō)明艾灸對(duì)肺纖維化有一定的防治作用,其療效與艾灸療程的長(zhǎng)短有關(guān),療程越長(zhǎng)其治療效果越佳。
　　(3)艾灸對(duì)肺纖維化