UFPs通過(guò)肺泡上皮細(xì)胞自噬紊亂誘導(dǎo)肺纖維化的機(jī)制研究.pdf

1、我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展帶來(lái)了當(dāng)前的空氣污染問(wèn)題，特別是反復(fù)出現(xiàn)的霧霾，引起了政府和公眾的關(guān)注。霧霾主要由大氣環(huán)境中存在的顆粒物(Particulate matter,PM)引起，特別是空氣動(dòng)力學(xué)直徑(AD)＜2.5μm的細(xì)顆粒物，一般稱為PM2.5。呼吸系統(tǒng)是顆粒物暴露的首要作用對(duì)象，流行病學(xué)研究顯示PM2.5與多種呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)，如慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌等。一般認(rèn)為，顆粒物的毒性與顆粒物的直徑密切相關(guān)，直徑越小，毒性越大，但當(dāng)前對(duì)

2、超細(xì)顆粒物（AD≤0.1μm，ultrafine particle，UFPs）的健康危害研究不夠全面與深入。需要指出的是，真實(shí)環(huán)境中的顆粒物樣本成分復(fù)雜，直徑分布不一，研究結(jié)果不易重復(fù)且難以分析。因此，實(shí)驗(yàn)室研究中常采用成分與直徑單一的人工合成顆粒物作為替代物。
　　肺纖維化是慢性肺疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要病理改變，表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞持續(xù)性損傷、成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖活化、尤其是膠原過(guò)度沉積，最終能引起呼吸衰竭。肺纖維化的機(jī)制尚未完全

3、闡明，但認(rèn)為由多種機(jī)制共同調(diào)控。早期研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)是介導(dǎo)肺纖維化的關(guān)鍵機(jī)制，細(xì)胞因子釋放、氧化應(yīng)激、成纖維細(xì)胞活化增殖在發(fā)病過(guò)程中也發(fā)揮重要作用;近期研究顯示，肺泡上皮細(xì)胞損傷同樣在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道表明UFPs經(jīng)肺灌注后，能夠誘導(dǎo)小鼠肺纖維化，但其發(fā)病機(jī)制的研究仍停留在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子等方面，UFPs是否可以通過(guò)直接損傷肺泡上皮細(xì)胞而誘導(dǎo)肺纖維化？尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。為探索UFPs對(duì)肺泡上皮細(xì)胞

4、的作用及其在肺纖維化中的貢獻(xiàn)，本學(xué)位論文擬以人工合成的納米級(jí)顆粒模擬大氣中的UFPs，研究該顆粒物誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷機(jī)制及其在小鼠肺纖維化中的作用。
　　為此，本論文首先采用小鼠肺灌注模型模擬人體呼吸道顆粒物暴露過(guò)程，建立UFPs誘導(dǎo)肺纖維化模型。暴露1個(gè)月后，檢測(cè)小鼠肺功能并收集小鼠的肺組織進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。呼吸功能檢測(cè)結(jié)果顯示，UFPs暴露顯著降低小鼠肺順應(yīng)性;UFPs暴露后解剖小鼠，肉眼觀察可見(jiàn)肺部呈現(xiàn)彌散狀白色斑點(diǎn)，且明顯

5、增大，肺臟器系數(shù)顯著增加;Masson染色及天狼猩紅膠原染色表明，UFPs處理組小鼠膠原纖維的含量較對(duì)照組明顯增加;組織羥輔氨酸分析證明，UFPs處理增加小鼠肺組織中羥輔氨酸含量;qRT-PCR檢測(cè)CTGF基因的結(jié)果顯示，UFPs暴露上調(diào)其表達(dá)量;免疫組化結(jié)果表明，肺組織中α-SMA的表達(dá)量在UFPs處理之后顯著上調(diào)。以上結(jié)果充分證明，UFPs誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵殉晒ⅰ?br>　　進(jìn)一步，我們采用電鏡觀察UFPs在小鼠肺組織

6、中的定位，結(jié)果顯示二型肺泡上皮細(xì)胞可以吞噬顆粒物，且肺組織凋亡增加。為了證明動(dòng)物水平的結(jié)果是正確的，我們對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行UFPs處理，同樣觀察到肺泡上皮細(xì)胞攝取UFPs，并發(fā)生凋亡。以上結(jié)果表明UFPs能夠靶向肺泡上皮細(xì)胞，提示肺泡上皮細(xì)胞損傷與UFPs誘導(dǎo)的肺纖維化相關(guān)。細(xì)胞自噬是真核生物中一種依賴溶酶體降解胞內(nèi)生物大分子和受損細(xì)胞器的過(guò)程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及應(yīng)對(duì)環(huán)境刺激中起重要作用，其紊亂已經(jīng)被證實(shí)參與了肺纖維化的多個(gè)過(guò)程。那

7、么，自噬是否參與UFPs誘導(dǎo)的肺纖維化呢？為此，在本論文的小鼠肺纖維化模型中，我們利用免疫印跡與免疫組化技術(shù)檢測(cè)了自噬相關(guān)分子，結(jié)果顯示自噬的主要分子標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ在UFPs暴露的小鼠肺組織中顯著上調(diào)，提示自噬可能參與了UFPs誘導(dǎo)的肺纖維化。
　　為了詳細(xì)闡明UFPs影響細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，我們?cè)诩?xì)胞水平開(kāi)展深入研究。以A549細(xì)胞為研究對(duì)象，本論文證實(shí)UFPs確實(shí)可以引起肺泡上皮細(xì)胞自噬泡聚集。進(jìn)一步，我們?nèi)鏅z測(cè)了UFPs

8、對(duì)自噬流的三個(gè)過(guò)程，即自噬泡生成、自噬溶酶體與自噬泡融合、自噬溶酶體降解的影響。結(jié)果顯示，UFPs不影響自噬調(diào)控蛋白mTOR的活性，說(shuō)明經(jīng)典的mTOR信號(hào)通路并未參與UFPs誘發(fā)的自噬泡聚集過(guò)程;免疫印跡檢測(cè)表明，UFPs處理并不促進(jìn)自噬性降解底物蛋白p62的降解，反而增加細(xì)胞內(nèi)p62蛋白水平，提示自噬泡聚集源自于自噬性降解的抑制。一般認(rèn)為，自噬泡形成之后，需要與溶酶體融合形成自噬溶酶體，繼而在自噬溶酶體內(nèi)完成對(duì)底物的降解過(guò)程。我們的結(jié)

9、果顯示，UFPs不影響自噬泡和溶酶體的融合，但能夠損傷溶酶體的降解能力。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，UFPs處理導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞的溶酶體腫脹，抑制溶酶體的正常酸化，從而抑制酸性水解酶（如組織蛋白酶D）的成熟。采用外加cAMP回復(fù)UFPs引起的溶酶體酸化抑制，可以加快細(xì)胞的自噬流降解，減少UFPs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UFPs可以上調(diào)A549細(xì)胞IL-1與IL-6的基因表達(dá)水平，而cAMP回復(fù)溶酶體酸化及rapamycin加快自

10、噬流均能夠下調(diào)IL-1與IL-6的水平，說(shuō)明超細(xì)顆粒物引起的自噬紊亂還可以調(diào)控炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)場(chǎng)采集的顆粒物樣本同樣能夠上調(diào)A549細(xì)胞中LC3，p62蛋白的表達(dá)，表明自噬流阻斷在真實(shí)暴露中同樣存在。
　　最后，本論文在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)細(xì)胞水平的研究結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。免疫印跡與免疫組化的結(jié)果表明，UFPs暴露上調(diào)小鼠肺組織中p62蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明體內(nèi)結(jié)果與體外一致，即UFPs抑制自噬性降解。進(jìn)一步，在體內(nèi)采用rapamycin加快自噬流干預(yù)

11、UFPs誘導(dǎo)肺纖維化的過(guò)程后，檢測(cè)肺纖維化相關(guān)的表型。天狼腥紅染色結(jié)果表明，小鼠暴露UFPs后用rapamycin進(jìn)行干預(yù)，膠原聚集顯著減輕;羥輔氨酸檢測(cè)結(jié)果顯示，rapamycin顯著下調(diào)小鼠肺組織中羥輔氨酸含量;此外，免疫組化結(jié)果可見(jiàn)rapamycin下調(diào)肺組織中α-SMA的表達(dá)量。以上結(jié)果充分證明rapamycin干預(yù)組小鼠肺纖維化明顯減輕，說(shuō)明自噬流阻斷是UFPs誘導(dǎo)肺纖維化的發(fā)病機(jī)制。
　　根據(jù)以上結(jié)果，我們得出結(jié)論:U