益腎清利活血法組方對(duì)腎間質(zhì)纖維化及腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程干預(yù)作用的研究.pdf

1、針對(duì)腎虛濕瘀的病理，治法上我們以益腎清利活血為立法原則，以治病求本、既病防變?yōu)榭傮w原則，一法為主，但又在具體組方時(shí)注意調(diào)理肺、脾、腎三臟，兼顧濕、熱、瘀三邪，從而達(dá)到扶助正氣以固本，祛除病邪以阻止腎纖維化進(jìn)展，并且兼具預(yù)防復(fù)發(fā)的作用。 無(wú)論腎臟病原發(fā)病因和部位在腎小球、腎小管還是腎血管，最終均可導(dǎo)致腎小管萎縮和消失、腎間質(zhì)增生和纖維化，腎功能的損害都與腎間質(zhì)纖維化病變的程度密切相關(guān)。這些疾病能引起腎小管上皮細(xì)胞的凋亡、腎間質(zhì)炎性

2、細(xì)胞的浸潤(rùn)、肌成纖維細(xì)胞的聚集，并在一些促纖維化因子的參與下，使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)生成增多、降解減少，而產(chǎn)生腎間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致腎功能?chē)?yán)重受損?？梢?jiàn)腎間質(zhì)纖維化與腎病慢性進(jìn)展密切相關(guān)。圍繞小管間質(zhì)損傷后的間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展及防治方面的研究受到廣泛重視，目前研究認(rèn)為腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機(jī)制可能與多種細(xì)胞(如腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞等)轉(zhuǎn)變或轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞(MyoFb)，其中TGF-β1可能是主要的致纖維化因子之一，導(dǎo)致小管上皮細(xì)胞

3、間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(TEMT)和細(xì)胞激活。通過(guò)臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，我們以益腎清利活血法組方，研究其對(duì)腎間質(zhì)纖維化的防治作用。通過(guò)以下幾個(gè)方面的研究來(lái)探討其作用機(jī)制。目的：1.闡明整體條件下，以益腎清利活血法組方的中藥對(duì)對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎間質(zhì)纖維化的拮抗作用。2.以益腎清利活血為法組方通過(guò)中藥含藥血清觀察中藥對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)細(xì)胞EMT過(guò)程的阻抑作用(以苯那普利作為對(duì)照)。方法：1.構(gòu)建UUO大鼠模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)組、

4、模型組、益腎清利活血低劑量組、益腎清利活血高劑量組及苯那普利組，在單側(cè)輸尿管梗阻術(shù)后21天通過(guò)免疫組化觀察UUO大鼠腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞EDl抗體、NF-кB、α-SMA、PCNA表達(dá)；通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚和酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT—PCR)半定量分析TGF—β1、PAI-1、BCL-2 mRNA的表達(dá)。2.利用人腎小管近端上皮細(xì)胞株(HK-2)，通過(guò)中藥含藥血清觀察益腎清利活血復(fù)方對(duì)HK-2細(xì)胞株轉(zhuǎn)分化過(guò)程中間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白表達(dá)、以及對(duì)腎小管上皮細(xì)胞

5、轉(zhuǎn)分化(EMT)發(fā)生的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中Smad4及RhoA mRNA的影響。結(jié)果：1.以益腎清利活血為法組方觀察中藥對(duì)UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的拮抗作用(以苯那普利作為對(duì)照)。 (1)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示益腎活血清利方對(duì)UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程有著顯著的干預(yù)作用，從血肌酐、尿素氮的測(cè)試結(jié)果可看出用藥組大鼠均未進(jìn)入腎功能不全(P<0.05)。(2)腎小管間質(zhì)損害程度參照國(guó)內(nèi)唐政分法病理積分顯示用藥各組則顯示對(duì)間質(zhì)纖維化不同程度的抑制作用，與

6、模型組比較差異有顯著性(P<0.01)。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示益腎清利活血方對(duì)腎組織羥脯氨酸形成有明顯的抑制作用(P

7、用 (P<0.01)。 (2)研究發(fā)現(xiàn)EDl表達(dá)減少的各組NF-κB表達(dá)亦輕，中藥各組對(duì)NF-κB的積聚與模型組比較有著明顯的抑制作用，但西藥組無(wú)顯著作用。 (3)研究顯示用藥各組與模型組比較均可阻抑α-SMA表達(dá)，但以益腎清利活血方作用最強(qiáng)(P<0.01)，苯那普利組，中藥高劑量組與模型組比較P<0.05。 (4)實(shí)驗(yàn)證實(shí)益腎清利活血方和西藥苯那普利在抑制PCNA的表達(dá)方面具有相近的作用(P<0.01)。

8、 3．分析益腎清利活血組方對(duì)從致纖維化因子TGF-β1、ECM降解抑制因子PAI-1及凋亡抑制因子BCL-2表達(dá)的影響，以明確益腎清利活血治療原則的抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。 (1)中藥低劑量組對(duì)TGF-β1的干預(yù)作用最強(qiáng)，與模型組比較有顯著療效(P<0.05)，而中藥高劑量組與西藥組作用弱于中藥低劑量組，無(wú)顯著意義。 (2)在UUO大鼠腎組織PAI-1 mRNA的表達(dá)結(jié)果提示，與模型組比較，中藥低劑量組與苯那普利組

9、均有較好的抑制PAI-1表達(dá)的作用(P<0.05)，而中藥高劑量組作用不明顯。 (3)我們實(shí)驗(yàn)觀察中藥低劑量組及中藥高劑量組BCL2 mRNA表達(dá)均有顯著的升高(P<0.05)，而苯那普利組則無(wú)明顯的作用。 4．以益腎清利活血為法組方通過(guò)中藥含藥血清觀察中藥對(duì)HK-2細(xì)胞(人腎近端小 管上皮細(xì)胞)EMT(小管細(xì)胞上皮向間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化)過(guò)程的阻抑作用(以 苯那普利作為對(duì)照)。分析益腎清利活血法組方含藥血清對(duì)HK

10、-2細(xì)胞EMT過(guò)程不 同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。 (1)波形蛋白的表達(dá)以中藥低劑量組最為顯著，其次為中藥高劑量(P<0.05)，苯那普利組作用不明顯。說(shuō)明它們對(duì)HK2細(xì)胞的EMT過(guò)程的抑制程度是依次減弱的。 (2)HK2細(xì)胞EMT過(guò)程中Smad4 mRNA的表達(dá)，與模型組比較，中藥低劑量組與苯那普利組(P<0.05)均體現(xiàn)出抑制作用，中藥高劑量組作用不明顯。 (3)HK2細(xì)胞EMI過(guò)程中RhoA mRNA的表達(dá)，中

11、藥高劑量組(P<0.05)有抑制其表達(dá)的作用，與模型組比較有顯著性意義；中藥低劑量組和苯那普利組無(wú)明顯作用。 結(jié)論： 1．SD大鼠經(jīng)輸尿管結(jié)扎21天后，用藥各組病理變化均較模型組減輕，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 顯示益腎清利活血方及洛汀新對(duì)UU0大鼠腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程有著顯著的干預(yù)作用，從血肌酐、尿素氮、腎間質(zhì)病理積分及羥脯氨酸的測(cè)試結(jié)果可看出用藥組大 鼠均未進(jìn)入腎功能不全。2．從間質(zhì)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)、核轉(zhuǎn)錄因子的激活、肌成纖維細(xì)胞的增

12、多及其增殖活性 的增強(qiáng)，UUO模型就具備了ECM積聚、纖維化形成的前提條件，我們通過(guò)免疫組 化從形態(tài)上觀察了UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化過(guò)程各個(gè)環(huán)節(jié)的變化，在EDl、α-SMA、 PCNA的表達(dá)方面中藥組和苯那普利組作用相近；而在NF-κB的表達(dá)上則是中藥 低劑量組與中藥高劑量組優(yōu)于苯那普利組。 3．我們選擇致纖維化因子TGF-β1、ECM降解抑制因子PAI-1及凋亡抑制因子BCL2 作為觀察指標(biāo)，通過(guò)RT-PCR的半定量分

13、析各治療組對(duì)UUO大鼠整體纖維化的調(diào) 控因子，與模型組相比，中藥低劑量組療效優(yōu)于中藥高劑量組及苯那普利組，并 且在抑制凋亡的方面作用是獨(dú)特而顯著的。 4．在探討中藥對(duì)腎小管上皮細(xì)胞(HK2)發(fā)生轉(zhuǎn)分化過(guò)程的多信號(hào)途徑干預(yù)作用的研 究中，發(fā)現(xiàn)用藥各組均有抑制HK2細(xì)胞EMT、環(huán)節(jié)的作用，在波形蛋白及Smad4的 表達(dá)上中藥低劑量組均顯示出抑制作用，苯那普利在Smad4的表達(dá)上有一定抑制 作用，在波形蛋白及RhoA的表達(dá)上