Pax2在腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及作用研究.pdf

1、終末期腎病(ESRD)是各種慢性腎臟疾病持續(xù)不愈、進(jìn)行性發(fā)展的最終結(jié)局。不論腎臟病的原始病因如何，其基礎(chǔ)病變是否靜止，腎臟都將緩慢、持續(xù)、不可逆地向著終末期腎功能衰竭進(jìn)展。迄今為止諸多的研究表明，以基質(zhì)蛋白合成增多、降解減少所造成的細(xì)胞外基質(zhì)的大量堆積導(dǎo)致的進(jìn)行性腎小管間質(zhì)纖維化是各種晚期腎臟病的共同特征，慢性腎臟疾病腎功能的惡化進(jìn)程取決于腎小管間質(zhì)纖維化的程度和范圍。因此積極探討慢性腎小管間質(zhì)纖維化的機(jī)制，尋找積極有效的防治措施，延緩

2、、阻滯腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展已成為國際腎臟病界的研究熱點之一。 細(xì)胞外基質(zhì)的大量堆積被普遍認(rèn)為是導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化的重要步驟。究其來源，腎間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及炎癥浸潤細(xì)胞都可能參與分泌。在這些細(xì)胞類型中，肌成纖維細(xì)胞的中心地位已經(jīng)被廣泛接受。肌成纖維細(xì)胞是一種特殊類型的細(xì)胞，兼具成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的特征，在正常腎臟中處于靜止?fàn)顟B(tài)，散在分布于腎間質(zhì)中，病理狀態(tài)下它們快速增殖，合成并分泌膠原，

3、促進(jìn)組織纖維化；其是成纖維細(xì)胞的一個亞類，表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA(α-smooth muscle actin)。它的出現(xiàn)被認(rèn)為是腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)展過程中的一個關(guān)鍵步驟，追溯肌成纖維細(xì)胞來源，越來越多的研究證實存在腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的逆向分化(EMT)。EMT是腎臟小管細(xì)胞丟失上皮細(xì)胞表型，獲得間葉細(xì)胞特征的過程，被認(rèn)為是胚胎時期間充質(zhì)細(xì)胞——上皮細(xì)胞分化(MET)的逆向分化過程。胚胎時期間充質(zhì)細(xì)胞一上皮細(xì)胞間的表型轉(zhuǎn)

4、化涉及了一系列參與、影響腎小管上皮細(xì)胞發(fā)育基因的開啟和關(guān)閉。我們推測，腎小管上皮細(xì)胞在受到損傷刺激后向間充質(zhì)細(xì)胞逆向分化的過程中，同樣涉及了這一系列參與、影響腎小管上皮細(xì)胞發(fā)育基因的啟動和表達(dá)，使得細(xì)胞的轉(zhuǎn)型得以完成，因此，我們選擇了這一系列基因中的成員Pax2進(jìn)行研究。Pax2是泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育的早期調(diào)控基因，屬于在進(jìn)化上高度保守的PairedBox Gene(PAX)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，對腎小管上皮細(xì)胞分化及腎臟發(fā)育起著重要的調(diào)控作用

5、，啟動胚胎腎發(fā)育時期間充質(zhì)細(xì)胞一上皮細(xì)胞分化(MET)的分化過程。病理狀態(tài)下可能啟動上皮細(xì)胞一間充質(zhì)細(xì)胞(EMT)的轉(zhuǎn)型。但：Pax2并非是獨(dú)立存在、獨(dú)立發(fā)揮作用的。本課題組的前期研究的WT1也是誘導(dǎo)腎臟胚胎發(fā)育過程中間充質(zhì)細(xì)胞-腎小管上皮細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因之一，并與Pax2相互作用。因此我們認(rèn)為，在控制、調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞一肌纖維母細(xì)胞間的逆向分化過程中，應(yīng)該有一組基因群的參與，它們在特定信號傳導(dǎo)機(jī)制的調(diào)控下，有序地開啟和關(guān)閉，執(zhí)行細(xì)

6、胞內(nèi)部地一系列功能活動。 研究表明局部或循環(huán)中的細(xì)胞因子在腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生逆向分化的過程中發(fā)揮著重要的作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensin-System，RAS)是胚胎期腎臟發(fā)育的過程中的重要的調(diào)控因子。AngⅡ作為RAS系統(tǒng)中最主要的血管活性肽，可引起細(xì)胞肥大并促進(jìn)基質(zhì)合成，在多種腎病中被激活。在腎臟纖維化的早期階段，RAS激活的成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞在腎臟疾病持續(xù)、不可逆性發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

7、 然而我們對急性缺血再灌注損傷動物模型的研究表明，腎小管細(xì)胞也可發(fā)生EMT，逆向分化為肌成纖維細(xì)胞，其對受損的腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行再生修復(fù)，此時腎臟并不發(fā)生纖維化。因而我們認(rèn)為逆向分化TEC的命運(yùn)尚有這樣一種可能：即腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化可能轉(zhuǎn)化為組織干細(xì)胞對損傷組織進(jìn)行修復(fù)。 CD133分子是組織干細(xì)胞的一個重要的表面標(biāo)志，研究發(fā)現(xiàn)，腎臟中CD133+細(xì)胞代表了一個多能的成體組織固有的干細(xì)胞群體，可修復(fù)損傷的腎小管。腎臟內(nèi)已

8、分化細(xì)胞的增殖及逆向分化在腎臟受損后的修復(fù)重建過程中發(fā)揮著比骨髓干細(xì)胞更重要的作用。對逆向分化細(xì)胞是否具有干細(xì)胞潛能的研究，將有助于我們深刻地認(rèn)識腎小管上皮細(xì)胞逆向分化的意義、細(xì)胞分化后的命運(yùn)以及逆向分化后細(xì)胞對受損組織的積極或消極修復(fù)作用。 為此，在本研究中，我們重點探究了成年腎小管上皮細(xì)胞受慢性損傷刺激時，發(fā)生逆向分化過程中的基因的序列表達(dá)和調(diào)控；逆向分化發(fā)生的可能機(jī)制；以及逆向分化后的腎小管上皮細(xì)胞生物學(xué)行為及命運(yùn)，從而進(jìn)

9、一步證實慢性損傷時成年腎小管上皮細(xì)胞逆向分化發(fā)生的精確機(jī)制及其意義。 我們假設(shè)：(1)在慢性腎臟疾病進(jìn)程中，由于特定病理損傷因素的作用，可能激發(fā)啟動了部分腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)以WT1和：Pax2為代表的基因序列，以控制腎小管上皮細(xì)胞的逆向分化過程，發(fā)生由上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的逆向分化的轉(zhuǎn)變。(2)受損局部的炎性因子(如局部RAS)可能對腎小管上皮細(xì)胞的逆向分化起誘導(dǎo)作用，參與其發(fā)生機(jī)制。(3)發(fā)生逆向分化的腎小管上皮細(xì)胞可能具有不同

10、的生物學(xué)行為，除了我們以前實驗已證實的致纖維化作用以外；其還可能受不同信號的調(diào)控獲得組織干細(xì)胞樣的增殖分化潛能，旨在參與腎臟損傷的修復(fù)過程。 為此，我們建立了慢性腎功能衰竭動物模型及細(xì)胞模型，用分子生物學(xué)、免疫化學(xué)等方法觀察了在腎臟慢性損傷時，腎小管上皮細(xì)胞逆向分化過程中，控制胚胎分化發(fā)育的關(guān)鍵基因WT1、Pax2等基因的序列表達(dá)及調(diào)控，試圖探討在慢性腎功能衰竭腎臟病理改變過程中WT1、Pax2基因重新啟動對成年腎小管上皮細(xì)胞逆

11、向分化的影響、分子學(xué)機(jī)制及相互聯(lián)系，腎臟局部炎性因子對EMT的影響。并進(jìn)一步研究了經(jīng)EMT后的腎小管上皮細(xì)胞的功能和命運(yùn)，即：①腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT由上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為向具有增殖分化潛能的間充質(zhì)細(xì)胞，在某些信號的介導(dǎo)下，這些獲得分化潛能的腎小管上皮細(xì)胞群可向腎小管上皮細(xì)胞方向分化，積極參與腎小管上皮細(xì)胞的再生修復(fù)：②腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生：EMT由上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為向具有增殖分化潛能的間充質(zhì)細(xì)胞，在另類信號的介導(dǎo)下，向纖維母細(xì)胞方向分化，通過分

12、泌細(xì)胞外基質(zhì)、形成纖維結(jié)締組織起到消極的修復(fù)作用，從而導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。 具體研究方法如下： 1．Pax2與胚胎/初生期腎臟發(fā)育之間關(guān)系的研究目的：觀察腎臟發(fā)育期間即胚胎期和新生期腎臟中Pax2的表達(dá)消漲情況，探討Pax2在腎臟發(fā)育過程中的可能作用，為下一步實驗做準(zhǔn)備。 小結(jié)：Pax2的表達(dá)與腎臟發(fā)育成熟時間之間的相關(guān)性提示了Pax2在腎臟胚胎發(fā)育中的重要作用。 2． Pax2與5/6腎部分

13、切除致慢性腎損傷之間關(guān)系的研究.(1)5/6腎部分切除致慢性腎損傷時Pax2重新啟動與腎小管上皮細(xì)胞逆向分化的關(guān)系目的：觀察控制腎小管上皮細(xì)胞胚胎發(fā)育時期的關(guān)鍵基因-Pax2在慢性腎損傷過程中是否重新表達(dá)及其表達(dá)情況，探討Pax2和腎小管上皮細(xì)胞逆向分化以及腎臟進(jìn)行性纖維化之間可能的內(nèi)在聯(lián)系。小結(jié)：胚胎發(fā)育基因Pax2在慢性腎損傷中重新一過性開放，可能是促使腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞逆向分化、腎小管間質(zhì)進(jìn)行性纖維化的內(nèi)在啟動機(jī)制；逆向

14、分化后的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志α-SMA。Pax2并非獨(dú)立作用的，其與WT1等一系列基因是相互作用、相互影響的，Pax2的雙峰表達(dá)模式證明了這一觀點。 (2)慢性腎損傷腎小管上皮細(xì)胞逆向分化機(jī)制研究——腎臟局部RAS與Pax2之間的關(guān)系目的：觀察體外培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞模型在局部RAS變化時，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)Pax2的表達(dá)和變化情況。探討腎臟局部RAS變化與Pax2基因之間的內(nèi)在聯(lián)系。小結(jié)：RAS與：EMT有明確關(guān)

15、聯(lián)，在體外RAS能夠激發(fā)。腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生逆向分化，表達(dá)腎臟胚胎發(fā)育基因Pax2，體外啟動腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生逆向分化。 3、腎小管上皮細(xì)胞逆向分化與干細(xì)胞潛能的獲得目的：體外建立局部不同濃度的RAS環(huán)境，觀察PETC細(xì)胞(NRK-52E)CD133分子的表達(dá)和變化情況及其與Pax2的關(guān)系。 小結(jié)：逆向分化的過程是腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為組織干細(xì)胞對組織損傷進(jìn)行修復(fù)的可能途徑，上皮細(xì)胞通過逆向分化獲得干細(xì)胞的潛能，表達(dá)腎組織

16、干細(xì)胞標(biāo)志CD133分子。 結(jié)論：Pax2是控制胚胎腎小管上皮細(xì)胞分化、發(fā)育的關(guān)鍵基因，在腎小管上皮細(xì)胞發(fā)育成熟后，Pax2表達(dá)幾近消失。腎臟受損后，Pax2在成年鼠腎小管上皮細(xì)胞中又可出現(xiàn)短暫重新表達(dá)，表現(xiàn)出開放-關(guān)閉-重新開放的表達(dá)模式，可能是腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生逆向分化以及腎間質(zhì)進(jìn)行性纖維化的內(nèi)在啟動機(jī)制。Pax2并非獨(dú)立作用的，其與WT1等一系列基因是相互作用、相互影響的。RAS作為胚胎期腎臟發(fā)育的過程中的重要的調(diào)控因子，