中藥腎絡(luò)通過UUO大鼠腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化機制的研究.pdf

1、目的:觀察單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)模型大鼠腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)的表達，檢測與其調(diào)控相關(guān)的信號通路因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、核因子-κB(nuclear factor，NF-κB)的改變，探討益氣活血通絡(luò)中藥腎絡(luò)通抑制UUO大鼠腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化的作用及機制，為該方的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　

2、　方法:選用健康雌性清潔級Wistar大鼠48只，體重180±20克，實驗動物自由進食和飲水，溫度條件控制在（22±2）℃。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，48只大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham group)、UUO組(UUO group)、依普利酮組(EPL group)、腎絡(luò)通組(SLT group)，每組12只。各組大鼠UUO造模方式如下:10％水合氯醛注射麻醉后，于左側(cè)中腹部切開皮膚，游離左側(cè)輸尿管，分別在輸尿管上1/3處和中1/3處用絲線結(jié)扎

3、，隨后切斷輸尿管，逐層縫合皮膚。假手術(shù)組僅將輸尿管游離但不結(jié)扎離斷。術(shù)后開始給藥，依普利酮組以100 mg/(kg.d)依普利酮藥物加入飼料中;腎絡(luò)通組以腎絡(luò)通煎劑26g/(kg.d)入水瓶飲用，假手術(shù)組及UUO組給予等容量生理鹽水飲用，均每天1次。連續(xù)干預(yù)10天。10天后，各組大鼠稱重后斷頭處死，留取血液標本，備檢;切取梗阻側(cè)腎臟，除去被膜后稱重，部分腎組織置于4％多聚甲醛固定，部分腎組織-70℃保存用于提取RNA及蛋白。免疫組化及W

4、estern Blot方法檢測TNF-α、NF-κB、α-SMA的表達。
　　結(jié)果:
　　1各組大鼠一般情況比較
　　假手術(shù)組大鼠一般情況良好:每日飲食、飲水量穩(wěn)定，體重逐步增長，毛發(fā)有光澤，活動敏捷，對外界刺激反應(yīng)靈敏。UUO組動物的進食量、飲水量、體重均有所下降，與UUO組相比，依普利酮組及腎絡(luò)通組大鼠梗阻側(cè)腎重、腎重/體重明顯下降(P＜0.01，P＜0.05)。
　　2各組大鼠腎組織病理形態(tài)學改變
　

5、　HE染色顯示，假手術(shù)組結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮細胞排列整齊，腎間質(zhì)有少量炎性細胞浸潤;UUO組腎小管明顯擴張，腎間質(zhì)大量炎性細胞浸潤，上皮細胞變性、濁腫、壞死、脫落;腎絡(luò)通組及依普利酮組亦可見腎小管擴張及上皮細胞變性壞死等，但炎性細胞浸潤明顯減少。
　　Masson染色顯示，假手術(shù)組可見少量膠原成分表達，主要位于腎小球、腎間質(zhì)及腎小管基底膜;UUO組腎臟結(jié)構(gòu)紊亂，腎間質(zhì)膠原成分明顯增多;腎絡(luò)通組及依普利酮組與假手術(shù)組相比膠原纖維顯著

6、增多，但較UUO組顯著減少。
　　3免疫組化檢測各組大鼠TNF-α、NF-κB、α-SMA表達
　　檢測TNF-α、NF-κB表達，結(jié)果顯示假手術(shù)組TNF-α、NF-κB呈弱表達，主要見于腎小管上皮細胞;UUO組表達明顯增強;依普利酮組及腎絡(luò)通組表達范圍及強度較UUO組均明顯減弱。
　　假手術(shù)組檢測α-SMA顯示假手術(shù)組僅在血管有陽性表達;UUO組表達明顯增強，見于腎小管上皮細胞及腎間質(zhì);依普利酮組及腎絡(luò)通組表達較假手

7、術(shù)組增強但明顯弱于UUO組。
　　4腎組織TNF-α的mRNA表達
　　Real time-PCR測定TNF-α mRNA表達結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，UUO組中TNF-α mRNA表達明顯增強;與UUO組相比，依普利酮組與腎絡(luò)通組均明顯下調(diào)。
　　5 Western Blot檢測各組大鼠TNF-α、NF-κB、α-SMA表達
　　采用Western Blot方法檢測TNF-α、NF-κB信號通路，結(jié)果顯示UUO

8、組TNF-α、NF-κB蛋白表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01）;與UUO組比較，依普利酮組及腎絡(luò)通組表達均下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　檢測α-SMA的表達，結(jié)果顯示UUO組表達顯著上調(diào)，與假手術(shù)組比較，有顯著差異(P＜0.01);依普利酮組及腎絡(luò)通組α-SMA表達較假手術(shù)組增強但明顯弱于UUO組。
　　結(jié)論:
　　1梗阻性腎病可誘導炎性介質(zhì)的分泌，刺激腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化，參與腎間質(zhì)纖維