骨髓間充質(zhì)干細胞干預大鼠腎小管上皮細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：⑴采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)與純化Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，并對其成脂特性進行鑒定。⑵探討骨髓間充質(zhì)干細胞移植對單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型大鼠腎小管上皮細胞凋亡的影響。⑶采用Brdu體外標記骨髓間充質(zhì)干細胞，再將標記的細胞移植到UUO模型動物體內(nèi)，觀察bMSCs經(jīng)過靜脈途徑移植后在腎臟的分布情況。 方法：①6周齡清潔級雄性Wistar大鼠，處死后浸泡于75％酒精中15min，頭部露出。無菌條件下取兩側(cè)股骨和脛骨，去除骨

2、表面附著的組織，用含10 萬U/L的青霉素和100ug/L的鏈霉素的0.01M的PBS 沖洗3-5 次，在無菌條件下，鉗掉骨端，將骨鉗成碎骨片，浸于PBS中15min，最后經(jīng)單細胞濾網(wǎng)濾過，1500轉(zhuǎn)，離心5min，棄上清，用含10％胎牛血清、10 萬U/L的青霉素和100ug/L的鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基重新懸浮細胞，繼而按4×105細胞/ml的細胞密度接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿中，置37℃、體積分數(shù)5％CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小

3、時后首次換液，去除漂浮的血細胞，以后每3天更換培養(yǎng)液，當細胞達到70％-80％融合時，用0.25％胰酶消化傳代?？刂埔让傅牧考跋瘯r間，可以有效去除混雜細胞。取第三代bMSCs，置于成脂細胞誘導液中培養(yǎng)21天后，行油紅O染色鑒定。②54只Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)對照組(n=18)、bMSC注射組（bMSC組，n=18）和生理鹽水注射組。bMSC組和PS組大鼠于UUO模型建立的同時經(jīng)下腔靜脈分別注入bMSCs和等體積生理鹽水。于建模

4、后第3、7和14天分批處死大鼠并采集血液及腎臟組織標本，Real-time PCR技術(shù)檢測腎小管細胞FasL、Bax mRNA表達，免疫組化染色檢測FasL蛋白表達及分布；TUNEL法檢測腎小管細胞凋亡，計算凋亡指數(shù)。③待細胞達培養(yǎng)皿底50％融合時，加入Brdu貯存液，調(diào)整終濃度為10μmol/L，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)48小時?？瞻讓φ战M不加Brdu，免疫熒光觀測。建立UUO模型，同時經(jīng)下腔靜脈注入1ml已制備好的Brdu標記的bMSCs懸液

5、；對照組（n=6）為生理鹽水注射組，結(jié)扎輸尿管的同時經(jīng)下腔靜脈注入1ml生理鹽水。于建模后第3、7和14天分批處死大鼠并采集腎臟組織標本，免疫組化染色檢測Brdu陽性細胞表達及分布。 結(jié)果：⑴bMSCs以分散的克隆集落方式生長，細胞為長梭形，高倍鏡下可見細胞核橢圓形，有2～3個清晰的核仁。經(jīng)成脂誘導培養(yǎng)7d后，細胞胞漿開始出現(xiàn)脂滴。誘導培養(yǎng)21d,油紅O染色后顯示細胞胞漿內(nèi)顆粒狀紅色脂滴形成。⑵與假手術(shù)組比較，bMSC組和PS組

6、建模后各時間點FasL、BaxmRNA及FasL蛋白表達均明顯上調(diào)，腎小管細胞凋亡指數(shù)顯著增加。建模后第3、7天時，bMSC組FasL、Bax mRNA和FasL蛋白表達的上調(diào)幅度及腎小管細胞凋亡指數(shù)的增加程度均明顯低于PS組；至建模后第14天時，bMSC組與PS組各項檢測指標比較差異均無統(tǒng)計學意義。⑶體外培養(yǎng)的bMSCs可被Brdu標記，標記率>95％。標記細胞移植入模型動物體內(nèi)后，腎臟組織內(nèi)未見到Brdu陽性細胞。 結(jié)論：①