基于P38MAPK信號傳導(dǎo)通路的腎康靈干預(yù)大鼠腎小管上皮細胞的機制研究.pdf

1、目的:通過觀察益腎活血中藥腎康靈對大鼠腎小管上皮細胞增殖情況的影響，及其對轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforminggrowthfactor-betal，TGF-β1）誘導(dǎo)腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化前后的p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白，包括p38絲裂素活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase,p38MAPK)、MAPK激酶3/6(MAPKKinas3/6,MKK3/6)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cA

2、MP-responsiveelementbindingprotein，CREB)，及α-平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）、纖維黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的調(diào)控，探討中藥腎康靈的抗腎臟纖維化作用機制，進一步完善原發(fā)性腎病綜合征(primarynephriticsyndrome，PNS)的發(fā)病機制及益腎活血中藥腎康靈的作用機理。
　　方法:體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞，利用TGF-β1干

3、預(yù)制備模型，采用四甲基偶氮唑藍比色法（methylthiazolyltetrazolium，MTT）檢測中藥腎康靈在24h、48h的不同藥物濃度對細胞增殖狀態(tài)的影響，選取最適合的濃度為最佳干預(yù)濃度。隨機將細胞分為正常組、TGF-β1組、腎康靈組，采用蛋白免疫印跡法(Westernboltting)檢測各組細胞中α-SMA的表達。將細胞分為正常組、TGF-β1組、腎康靈組、SB203580組，檢測各組細胞中的p38MAPK、MKK3/6和

4、CREB及其磷酸化蛋白的表達，并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測各組細胞FNmRNA的蛋白表達。每個實驗重復(fù)四次，采用單因素方差或t檢驗分析實驗數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:①MTT結(jié)果顯示:6.25ug/ml-100ug/ml5個不同濃度的腎康靈溶液干預(yù)24h后，各組細胞增值率較空白組均無顯著性變化（P均＞0.05）;48h后各濃度組增值率均出現(xiàn)了顯著性增高(P～0.000＜0.01);其中6.25ug/ml、12.5ug/ml

5、、25ug/ml濃度組的細胞增殖率隨著藥物濃度的升高而增加（P均＜0.01），雖然50ug/ml與100ug/ml濃度組的細胞增殖率仍有增長的趨勢，但與25ug/ml組相比，增值率無統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05）。②Westernblot結(jié)果顯示:1）與空白組相比，TGF-β1組的α-SMA的表達明顯上調(diào)（P=0.01＜0.05）;而腎康靈組α-SMA的表達有所下調(diào)(P=0.018＜0.05)。2)與空白組相比，TGF-β1組的p38MA

6、PK相關(guān)蛋白包括MKK3/6、p38、CREB磷酸化水平增加(P均＜0.05)，而腎康靈組磷酸化水平有所下降(PMKK=0.012＜0.05、Pp38=0.015＜0.05、PCREB=0.011＜0.05)，SB203580組的相關(guān)蛋白磷酸化表達可恢復(fù)正常水平(PMKK=0.001＜0.01、Pp38=0.004＜0.01、PCREB=0.0061＜0.01)。③逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示:與空白組相比，TGF-β1組FNmRNA的表達顯著