基于P38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的腎康靈干預(yù)大鼠腎小管上皮細(xì)胞的機(jī)制研究.pdf

1、目的:通過(guò)觀察益腎活血中藥腎康靈對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞增殖情況的影響，及其對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforminggrowthfactor-betal，TGF-β1）誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化前后的p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白，包括p38絲裂素活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase,p38MAPK)、MAPK激酶3/6(MAPKKinas3/6,MKK3/6)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cA

2、MP-responsiveelementbindingprotein，CREB)，及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）、纖維黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的調(diào)控，探討中藥腎康靈的抗腎臟纖維化作用機(jī)制，進(jìn)一步完善原發(fā)性腎病綜合征(primarynephriticsyndrome，PNS)的發(fā)病機(jī)制及益腎活血中藥腎康靈的作用機(jī)理。
　　方法:體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞，利用TGF-β1干

3、預(yù)制備模型，采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（methylthiazolyltetrazolium，MTT）檢測(cè)中藥腎康靈在24h、48h的不同藥物濃度對(duì)細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響，選取最適合的濃度為最佳干預(yù)濃度。隨機(jī)將細(xì)胞分為正常組、TGF-β1組、腎康靈組，采用蛋白免疫印跡法(Westernboltting)檢測(cè)各組細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)。將細(xì)胞分為正常組、TGF-β1組、腎康靈組、SB203580組，檢測(cè)各組細(xì)胞中的p38MAPK、MKK3/6和

4、CREB及其磷酸化蛋白的表達(dá)，并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞FNmRNA的蛋白表達(dá)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)四次，采用單因素方差或t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:①M(fèi)TT結(jié)果顯示:6.25ug/ml-100ug/ml5個(gè)不同濃度的腎康靈溶液干預(yù)24h后，各組細(xì)胞增值率較空白組均無(wú)顯著性變化（P均＞0.05）;48h后各濃度組增值率均出現(xiàn)了顯著性增高(P～0.000＜0.01);其中6.25ug/ml、12.5ug/ml

5、、25ug/ml濃度組的細(xì)胞增殖率隨著藥物濃度的升高而增加（P均＜0.01），雖然50ug/ml與100ug/ml濃度組的細(xì)胞增殖率仍有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但與25ug/ml組相比，增值率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。②Westernblot結(jié)果顯示:1）與空白組相比，TGF-β1組的α-SMA的表達(dá)明顯上調(diào)（P=0.01＜0.05）;而腎康靈組α-SMA的表達(dá)有所下調(diào)(P=0.018＜0.05)。2)與空白組相比，TGF-β1組的p38MA

6、PK相關(guān)蛋白包括MKK3/6、p38、CREB磷酸化水平增加(P均＜0.05)，而腎康靈組磷酸化水平有所下降(PMKK=0.012＜0.05、Pp38=0.015＜0.05、PCREB=0.011＜0.05)，SB203580組的相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)可恢復(fù)正常水平(PMKK=0.001＜0.01、Pp38=0.004＜0.01、PCREB=0.0061＜0.01)。③逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示:與空白組相比，TGF-β1組FNmRNA的表達(dá)顯著