模擬缺血再灌注損傷誘導腎小管上皮細胞凋亡及其與p38MAPK信號通路的相關(guān)性.pdf

1、背景:腎臟為高灌注器官，非常容易發(fā)生缺血再灌注(ischemia／reperfusion，I／R)損傷。臨床上因I／R損傷導致的急性腎功能衰竭十分常見。既往的研究認為腎臟缺血再灌注損傷中的腎小管上皮細胞死亡主要是細胞壞死。然而近年來研究證實腎小管細胞凋亡在腎臟缺血再灌注時的細胞死亡中起重要作用而且可能是引起腎功能衰竭的重要機制。目前缺血再灌注損傷中腎小管上皮細胞凋亡的具體機制仍不清楚。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶中的一個亞類，通常

2、在機體受到各種應激刺激時被激活，介導細胞的生長、分化、增殖、死亡等生物學反應。目前有文獻報道p38信號通路的激活是腎缺血再灌注后細胞凋亡的發(fā)生機制之一。以往的研究證實p38MAPK的激活在無創(chuàng)腎動脈夾閉45min所致腎缺血再灌注損傷的發(fā)生中具有明顯的促細胞凋亡作用，但p38MAPK的激活是否也介導了模擬缺血再灌注損傷中離體培養(yǎng)的腎小管上皮細胞凋亡，目前國內(nèi)尚未見報道。本課題采用離體純化培養(yǎng)的SD大鼠腎小管上皮細胞建立模擬缺血再灌注損傷模

3、型，觀察在該損傷過程中腎小管上皮細胞的凋亡現(xiàn)象以及p38MAPK的抑制劑-SB203580對模擬缺血再灌注損傷誘導SD大鼠腎小管上皮細胞凋亡的影響，以期為臨床治療腎缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。 目的: 1．觀察模擬缺血再灌注損傷誘導腎小管上皮細胞凋亡的作用，探討兩者間的關(guān)系。 2．觀察p38MAPK在模擬缺血再灌注損傷后的活性變化及p38MAPK的抑制劑-SB203580對凋亡的影響，探討p38信號通路在模擬缺血

4、再灌注損傷后腎小管上皮細胞凋亡中的作用。 方法: 1．模擬缺血模型建立及模擬缺血再灌注損傷與腎小管上皮細胞凋亡的關(guān)系：采用膠原酶消化法、Percoll密度梯度離心法、差速貼壁法分離、純化培養(yǎng)腎小管上皮細胞。分離的腎小管節(jié)段培養(yǎng)于DMEM/F12中。cytokeratin18免疫細胞化學法及透射電鏡鑒定腎小管上皮細胞；以缺氧(5％CO<,2>、1％O<,2、94％N<,2>)+無糖KR液模擬缺血、復氧復糖模擬再灌注誘導腎小

5、管上皮細胞凋亡，用Hoechst33258染色法、流式細胞儀法觀察正常對照組及模型損傷組于模擬缺血1h復灌6、12、24、48h細胞凋亡的情況及變化規(guī)律。 2．p38信號通路在模擬缺血再灌注后腎小管上皮細胞凋亡中的作用：在進行模擬缺血再灌注損傷前1h，應用p38MAPK的特異性抑制劑SB203580，然后按照模型組進行細胞損傷，選擇模擬缺血1h復灌后24h時，用流式細胞儀及TUNNEL染色法檢測不同劑量(0.2、2、20umol

6、·L<'-1>)p38MAPK的抑制劑SB203580對腎小管上皮細胞凋亡的影響。用Western blot法檢測模擬缺血1h復灌30min后正常對照組、模型損傷組及SB用藥組(0.2、2、20μmol·L<,-1>)p38MAPK的蛋白表達、激活及SB203580對磷酸化p38MAPK的抑制情況。 結(jié)果: 1．腎小管上皮細胞原代培養(yǎng)及傳代：倒置顯微鏡下觀察，原代分離的腎小管節(jié)段12～24h貼壁；24h后有少量上皮樣細胞

7、從腎小管節(jié)段周邊爬出；72～96h后見細胞呈指數(shù)樣生長；120h后細胞已基本能達到融合，鏡下觀察可見細胞體積較大，細胞間緊密相連融合成片及呈復層生長，核較大呈橢圓形，多見有2～3個核仁，呈多邊鵝卵石鋪路樣。傳代后的細胞生長迅速，約3～5日后可傳第2代，傳3代后細胞生長漸漸緩慢，往往不能進一步傳下去。cytokerainl8免疫細胞化學法及透射電鏡鑒定腎小管上皮細胞純度達97％～98％，證明本研究中腎小管上皮細胞的分離、純化及體外培養(yǎng)成功

8、可行。 2．I/R損傷模型建立及模擬I/R損傷與腎小管上皮細胞凋亡的關(guān)系：模擬缺血1h復灌12h時倒置顯微鏡下觀察到了腎小管上皮細胞的形態(tài)學變化、Hoechst染色法觀察到細胞凋亡核的變化，流式細胞儀分析細胞再灌注6、12、24、48h的凋亡率分別達(7.5±1.1)％、(10.9±2.5)％、(16.0±1.9)％、(22.3±4.9)％，與正常對照組相比均有顯著性差異。相關(guān)分析表明，模擬缺血再灌注損傷所誘導的腎小管上皮細胞凋

9、亡率的增加與再灌注時間的延長具有顯著正相關(guān)(r=0.922，p<0.01)。 3．p38信號通路在模擬缺血再灌注后腎小管上皮細胞凋亡中的作用：(1)模擬缺血1h復灌24h時應用p38MAPK的特異性抑制劑SB203580(0.2、2、20μmo1-L<'-1>)，經(jīng)流式細胞儀檢測三個不同劑量組均可降低再灌注24h的腎小管上皮細胞凋亡百分率(三個劑量組的凋亡率分別為14.6±2.2％、13.2±1.3％、9.2±1.3％)，以20

10、μmol-L<'-1>組效果最好(p次之(p<0.05)，0.2μmol-L<'-1>組與模型組相比盡管細胞凋亡率有所下降，但無顯著性差異(p>0.05)。進一步用TUNNEL染色法也驗證了流式細胞儀的檢測結(jié)果。實驗結(jié)果表明：在一定范圍內(nèi)，隨著SB203580劑量的增加，凋亡細胞百分率漸呈下降，SB203580似呈濃度依賴性抑制細胞凋亡。(2)模擬缺血1h復灌30min時用Western blo

11、t法檢測正常對照組、模型損傷組及SB不同劑量預處理組p38MAPK的表達、激活情況：Western blot結(jié)果顯示，在腎小管上皮細胞模擬缺血1h復灌30min后，細胞內(nèi)的磷酸化p38MAPK活性明顯增高，與正常對照組相比具有顯著性差異(p<0.01)，在模擬缺血前應用不同劑量的SB203580預處理細胞，均可不同程度的降低模擬缺血再灌注損傷引起的細胞內(nèi)p38MAPK磷酸化灰度值。其中，與I/R組相比，應用中、大劑量組的SB203580

12、可顯著性降低p-p38MAPK的灰度值(p<0.01)，小劑量組則無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。而各組細胞內(nèi)的總的p38MAPK水平不變。 結(jié)論: 1．采用膠原酶消化、Percoll密度梯度離心法成功地進行了SD大鼠腎小管上皮細胞體外培養(yǎng)并傳3代。建立了物理方法的模擬缺血再灌注細胞損傷模型，并經(jīng)Hoechst核染色、流式細胞儀凋亡率分析、TUNNEL法證實體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞在經(jīng)歷模擬缺血再灌注損傷后可誘導細胞凋亡，