模擬缺血再灌注損傷誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡及其與p38MAPK信號(hào)通路的相關(guān)性.pdf

1、背景:腎臟為高灌注器官，非常容易發(fā)生缺血再灌注(ischemia／reperfusion，I／R)損傷。臨床上因I／R損傷導(dǎo)致的急性腎功能衰竭十分常見(jiàn)。既往的研究認(rèn)為腎臟缺血再灌注損傷中的腎小管上皮細(xì)胞死亡主要是細(xì)胞壞死。然而近年來(lái)研究證實(shí)腎小管細(xì)胞凋亡在腎臟缺血再灌注時(shí)的細(xì)胞死亡中起重要作用而且可能是引起腎功能衰竭的重要機(jī)制。目前缺血再灌注損傷中腎小管上皮細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制仍不清楚。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶中的一個(gè)亞類，通常

2、在機(jī)體受到各種應(yīng)激刺激時(shí)被激活，介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖、死亡等生物學(xué)反應(yīng)。目前有文獻(xiàn)報(bào)道p38信號(hào)通路的激活是腎缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制之一。以往的研究證實(shí)p38MAPK的激活在無(wú)創(chuàng)腎動(dòng)脈夾閉45min所致腎缺血再灌注損傷的發(fā)生中具有明顯的促細(xì)胞凋亡作用，但p38MAPK的激活是否也介導(dǎo)了模擬缺血再灌注損傷中離體培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題采用離體純化培養(yǎng)的SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞建立模擬缺血再灌注損傷模

3、型，觀察在該損傷過(guò)程中腎小管上皮細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象以及p38MAPK的抑制劑-SB203580對(duì)模擬缺血再灌注損傷誘導(dǎo)SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，以期為臨床治療腎缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。 目的: 1．觀察模擬缺血再灌注損傷誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用，探討兩者間的關(guān)系。 2．觀察p38MAPK在模擬缺血再灌注損傷后的活性變化及p38MAPK的抑制劑-SB203580對(duì)凋亡的影響，探討p38信號(hào)通路在模擬缺血

4、再灌注損傷后腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用。 方法: 1．模擬缺血模型建立及模擬缺血再灌注損傷與腎小管上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系：采用膠原酶消化法、Percoll密度梯度離心法、差速貼壁法分離、純化培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞。分離的腎小管節(jié)段培養(yǎng)于DMEM/F12中。cytokeratin18免疫細(xì)胞化學(xué)法及透射電鏡鑒定腎小管上皮細(xì)胞；以缺氧(5％CO<,2>、1％O<,2、94％N<,2>)+無(wú)糖KR液模擬缺血、復(fù)氧復(fù)糖模擬再灌注誘導(dǎo)腎小

5、管上皮細(xì)胞凋亡，用Hoechst33258染色法、流式細(xì)胞儀法觀察正常對(duì)照組及模型損傷組于模擬缺血1h復(fù)灌6、12、24、48h細(xì)胞凋亡的情況及變化規(guī)律。 2．p38信號(hào)通路在模擬缺血再灌注后腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用：在進(jìn)行模擬缺血再灌注損傷前1h，應(yīng)用p38MAPK的特異性抑制劑SB203580，然后按照模型組進(jìn)行細(xì)胞損傷，選擇模擬缺血1h復(fù)灌后24h時(shí)，用流式細(xì)胞儀及TUNNEL染色法檢測(cè)不同劑量(0.2、2、20umol

6、·L<'-1>)p38MAPK的抑制劑SB203580對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。用Western blot法檢測(cè)模擬缺血1h復(fù)灌30min后正常對(duì)照組、模型損傷組及SB用藥組(0.2、2、20μmol·L<,-1>)p38MAPK的蛋白表達(dá)、激活及SB203580對(duì)磷酸化p38MAPK的抑制情況。 結(jié)果: 1．腎小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代：倒置顯微鏡下觀察，原代分離的腎小管節(jié)段12～24h貼壁；24h后有少量上皮樣細(xì)胞

7、從腎小管節(jié)段周邊爬出；72～96h后見(jiàn)細(xì)胞呈指數(shù)樣生長(zhǎng)；120h后細(xì)胞已基本能達(dá)到融合，鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞體積較大，細(xì)胞間緊密相連融合成片及呈復(fù)層生長(zhǎng)，核較大呈橢圓形，多見(jiàn)有2～3個(gè)核仁，呈多邊鵝卵石鋪路樣。傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，約3～5日后可傳第2代，傳3代后細(xì)胞生長(zhǎng)漸漸緩慢，往往不能進(jìn)一步傳下去。cytokerainl8免疫細(xì)胞化學(xué)法及透射電鏡鑒定腎小管上皮細(xì)胞純度達(dá)97％～98％，證明本研究中腎小管上皮細(xì)胞的分離、純化及體外培養(yǎng)成功

8、可行。 2．I/R損傷模型建立及模擬I/R損傷與腎小管上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系：模擬缺血1h復(fù)灌12h時(shí)倒置顯微鏡下觀察到了腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化、Hoechst染色法觀察到細(xì)胞凋亡核的變化，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞再灌注6、12、24、48h的凋亡率分別達(dá)(7.5±1.1)％、(10.9±2.5)％、(16.0±1.9)％、(22.3±4.9)％，與正常對(duì)照組相比均有顯著性差異。相關(guān)分析表明，模擬缺血再灌注損傷所誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋

9、亡率的增加與再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)具有顯著正相關(guān)(r=0.922，p<0.01)。 3．p38信號(hào)通路在模擬缺血再灌注后腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用：(1)模擬缺血1h復(fù)灌24h時(shí)應(yīng)用p38MAPK的特異性抑制劑SB203580(0.2、2、20μmo1-L<'-1>)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)三個(gè)不同劑量組均可降低再灌注24h的腎小管上皮細(xì)胞凋亡百分率(三個(gè)劑量組的凋亡率分別為14.6±2.2％、13.2±1.3％、9.2±1.3％)，以20

10、μmol-L<'-1>組效果最好(p次之(p<0.05)，0.2μmol-L<'-1>組與模型組相比盡管細(xì)胞凋亡率有所下降，但無(wú)顯著性差異(p>0.05)。進(jìn)一步用TUNNEL染色法也驗(yàn)證了流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在一定范圍內(nèi)，隨著SB203580劑量的增加，凋亡細(xì)胞百分率漸呈下降，SB203580似呈濃度依賴性抑制細(xì)胞凋亡。(2)模擬缺血1h復(fù)灌30min時(shí)用Western blo

11、t法檢測(cè)正常對(duì)照組、模型損傷組及SB不同劑量預(yù)處理組p38MAPK的表達(dá)、激活情況：Western blot結(jié)果顯示，在腎小管上皮細(xì)胞模擬缺血1h復(fù)灌30min后，細(xì)胞內(nèi)的磷酸化p38MAPK活性明顯增高，與正常對(duì)照組相比具有顯著性差異(p<0.01)，在模擬缺血前應(yīng)用不同劑量的SB203580預(yù)處理細(xì)胞，均可不同程度的降低模擬缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞內(nèi)p38MAPK磷酸化灰度值。其中，與I/R組相比，應(yīng)用中、大劑量組的SB203580

12、可顯著性降低p-p38MAPK的灰度值(p<0.01)，小劑量組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。而各組細(xì)胞內(nèi)的總的p38MAPK水平不變。 結(jié)論: 1．采用膠原酶消化、Percoll密度梯度離心法成功地進(jìn)行了SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)并傳3代。建立了物理方法的模擬缺血再灌注細(xì)胞損傷模型，并經(jīng)Hoechst核染色、流式細(xì)胞儀凋亡率分析、TUNNEL法證實(shí)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞在經(jīng)歷模擬缺血再灌注損傷后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，