甘露醇誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞損傷及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　臨床病理資料和大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，長時(shí)間大劑量給予甘露醇會(huì)導(dǎo)致腎近端小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的空泡樣變性，上皮細(xì)胞腫脹，腎皮質(zhì)淤血等各種腎小管病理形態(tài)改變并誘發(fā)急性腎損傷。前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，較高劑量的甘露醇會(huì)損傷腎小管上皮細(xì)胞。在本研究中，我們將通過建立甘露醇體外損傷腎小管上皮細(xì)胞模型，進(jìn)一步研究甘露醇的細(xì)胞毒性及其潛在的損傷機(jī)制。
　　方法：
　　通過MTT比色法檢測(cè)甘露醇不同濃度（0、50、100、

2、150、200、250、300、400 mmol/L）分別作用不同時(shí)間（4、10、24、48、72 h）對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）活性的影響，同時(shí)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。用含有0、100、250 mmol/L的甘露醇作用于HK-2細(xì)胞24、48、72 h之后，收集細(xì)胞，超聲破碎，分光光度法檢測(cè)細(xì)胞勻漿液中脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛(MDA）的含量和細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）的含量。用含有0、100、250 mmol/L的甘露醇孵育

3、HK-2細(xì)胞48 h后，收集各組細(xì)胞，AnnexinV-FITC雙染法進(jìn)行標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。此外，用不同濃度的甘露醇處理 HK-2細(xì)胞不同時(shí)間后，將細(xì)胞固定，細(xì)胞核用 DAPI標(biāo)記，細(xì)胞中的 F-actin蛋白用 FITC-phalloidin（鬼筆環(huán)肽）進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，在顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架的改變。
　　結(jié)果：
　?、臡TT結(jié)果顯示，細(xì)胞的活性隨著甘露醇濃度（100~400 mmol/L）的增加和

4、作用時(shí)間(24~72 h)的延長而逐漸下降，在250 mmol/L甘露醇孵育48 h時(shí)，細(xì)胞活力約為對(duì)照組細(xì)胞的一半。⑵倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中，細(xì)胞呈鋪路石狀，伸展平鋪在板底，且貼壁生長情況良好。而在250 mmol/L甘露醇作用48 h組，細(xì)胞明顯出現(xiàn)腫脹變大，胞膜破裂，大部分貼壁細(xì)胞出現(xiàn)脫落，而且隨著甘露醇濃度的增加和作用時(shí)間的延長，可以觀察到貼壁細(xì)胞密度明顯減少。⑶細(xì)胞中MDA和GSH的含量變化：在250 mmol

5、/L甘露醇的作用下，HK-2細(xì)胞中MDA含量隨著作用時(shí)間的延長而增多。250 mmol/L甘露醇分別孵育細(xì)胞24、48、72 h后，MDA含量增高，與各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。甘露醇降低細(xì)胞內(nèi) GSH含量，而且呈時(shí)間劑量依賴性。在250 mmol/L甘露醇作用48 h組，GSH含量降低到18.3±4.3?mol/g，顯著低于對(duì)照組（52.2±1.6?mol/g）（P<0.05）。⑷流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，250