腎臟疾病狀態(tài)下金納米粒對腎小管上皮細胞的損傷及其機制研究.pdf

1、目的:
　　金納米粒（gold nanoparticles，GNPs）由于制備簡單、理化性質(zhì)穩(wěn)定、光學性質(zhì)可控以及無顯著毒性等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于生命科學和醫(yī)學領(lǐng)域。但是近年研究發(fā)現(xiàn)金納米粒在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用仍然存在著許多不確定的因素，且對機體主要排泄器官-腎臟的相關(guān)研究較少，特別是疾病狀態(tài)下的毒理作用尚未見報道。顯然，開展相關(guān)研究對于加快GNPs臨床應(yīng)用具有重要意義。
　　慢性腎臟病(chronic kidney disea

2、se，CKD)是一組具有高患病率、高死亡率的嚴重威脅人類生命健康的慢性進展性疾病。腎小管損傷以及間質(zhì)纖維化是慢性腎臟病腎功能減退的關(guān)鍵因素。值得注意的是:藥物及毒物性腎損傷多累及腎小管上皮細胞;缺氧是細胞最常見的病理狀態(tài)，腎臟病變時，腎小管上皮細胞常存在缺氧?；诖耍覀兲岢霰狙芯考僬f:腎臟病時腎小球濾過膜損傷，GNPs進入尿液增加，繼之被腎小管上皮細胞重吸收，從而對后者造成損傷;若伴有缺氧，GNPs將加重腎小管上皮細胞損傷，并促進小管

3、間質(zhì)纖維化。為了驗證上述假說，本研究應(yīng)用阿霉素腎病小鼠模型和體外細胞培養(yǎng)的腎小管上皮細胞、巨噬細胞，借助多種手段，觀察GNPs對腎小管上皮細胞的損傷作用，并探討相關(guān)機制。
　　方法:
　　1.用化學還原法制備粒徑分別為5nm和13nm的GNPs，并用TEM、DLS和UV—vis光譜等表征手段對其進行表征。
　　2.通過單次鼠尾靜脈注射阿霉素構(gòu)建阿霉素腎病小鼠模型，以正常的BALB/C小鼠作為對照，將5nm和13nm的G

4、NPs通過尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)、病理組織切片、透射電鏡切片、TUNEL凋亡染色等方法研究納米粒在小鼠體內(nèi)的吸收、分布，并觀察其對阿霉素腎病小鼠腎臟的損傷情況。
　　3.GNPs處理缺氧培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞，觀察腎小管上皮細胞攝取金納米粒、細胞的增殖活性變化，并檢測細胞自噬、凋亡和氧化應(yīng)激水平。

5、>　　4.用GNPs處理缺氧培養(yǎng)的巨噬細胞，收集培養(yǎng)上清，繼之用培養(yǎng)上清處理腎小管上皮細胞，觀察GNPs對缺氧的巨噬細胞NLRP3炎性小體激活以及產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)對腎小管上皮細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymaltransition, EMT)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.成功合成了符合要求的粒徑5nm和13nm、大小均勻、分散性良好、性質(zhì)穩(wěn)定的金納米顆粒，滿足了后續(xù)實驗要求。
　　2.通過單

6、次鼠尾靜脈注射10mg/kg阿霉素成功建立了阿霉素腎病小鼠模型。ICP-MS檢測結(jié)果顯示，5nm GNPs經(jīng)靜脈注射至阿霉素腎病小鼠后在其腎臟內(nèi)的聚集增加。組織學和透射電鏡研究發(fā)現(xiàn)，實驗組腎臟易見腎小管上皮細胞水腫（顆粒變性和空泡變性）以及蛋白管型。TUNEL染色證實5nm GNPs增加阿霉素腎病小鼠腎小管上皮細胞凋亡。
　　3.光鏡及透射電鏡檢查均發(fā)現(xiàn)，GNPs更易聚集于缺氧細胞內(nèi)，并伴有自噬體和空泡形成增加。CCK-8和LDH

7、檢查結(jié)果顯示，5nm GNPs在缺氧HK-2細胞內(nèi)的聚集能夠造成細胞生存力降低，加重細胞膜的破壞，促進細胞中LDH的漏出。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測顯示，5nm的GNPs(50 nM)可以有效地誘導(dǎo)缺氧HK-2細胞凋亡。TEM和免疫熒光的結(jié)果提示，5nm的GNPs(50 nM)可促進細胞自噬，且該作用在缺氧情況下明顯增強。自噬抑制劑(3-MA)處理后發(fā)現(xiàn)，在常氧條件下，自噬可抑制GNPs誘導(dǎo)的細胞凋亡，但在缺氧時自噬可促進

8、GNPs引起的細胞凋亡。GNPs處理后，缺氧細胞ROS水平明顯增加，線粒體膜電位顯著下降。
　　4.GNPs在缺氧的巨噬細胞內(nèi)的聚集也較常氧情況下明顯增加，聚集的GNPs能降低缺氧細胞的增殖能力，破壞缺氧細胞的細胞膜。qRT-PCR和Western Blot的結(jié)果提示，50nM GNPs在缺氧情況下可以誘導(dǎo)巨噬細胞NLRP3炎性體的活化，進而誘導(dǎo)Caspase-1和IL-1β的釋放增加，且ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acet

9、yl-cysteine，NAC)能顯著抑制GNPs誘導(dǎo)的缺氧細胞NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表達，說明ROS在GNPs促進缺氧細胞NLRP3炎性體活化中起了重要作用。Western Blot和免疫熒光的結(jié)果顯示，5nm的GNPs(50nM)誘導(dǎo)的缺氧巨噬細胞IL-1β的分泌可以顯著提高缺氧HK-2細胞間皮特異性標記α-SMA表達率，而降低上皮特異性標志物E-cad的表達。z-VAD-fmk可顯著抑制GNPs誘導(dǎo)的巨噬細胞

10、Caspase-1和IL-1β產(chǎn)生，同時該抑制劑還可使HK-2細胞α-SMA的表達顯著降低，而E-cadherin的表達增加。這些結(jié)果共同提示5nm的GNPs(50nM)誘導(dǎo)的缺氧巨噬細胞IL-1β的分泌可以促進缺氧腎小管上皮細胞EMT的發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　1.阿霉素腎病小鼠腎臟內(nèi)5nm GNPs聚集增多，提示腎臟疾病狀態(tài)下GNPs更易蓄積于腎臟，從而加劇腎臟損傷，且這一作用可能是通過促進腎小管上皮細胞水腫和凋亡而實現(xiàn)。

11、
　　2.常氧情況下，GNPs進入細胞后可誘導(dǎo)細胞自噬，使受損蛋白、細胞器等降解以維持細胞生存;而在缺氧情況下，進入細胞內(nèi)的納米粒增加，誘導(dǎo)過度自噬，促進細胞凋亡。ROS的明顯增加和線粒體膜電位的顯著下降可能是GNPs促進缺氧細胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　3.缺氧情況下，GNPs在巨噬細胞內(nèi)亦聚集增加，可引起細胞增殖活性下降并誘導(dǎo)巨噬細胞炎性體的活化，進而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng);而GNPs誘導(dǎo)的缺氧巨噬細胞IL-1β的分泌可以促進缺氧腎小