BMP-7對馬兜鈴酸致人腎小管上皮細胞損傷的保護作用研究.pdf

1、背景和目的:
　　 近年來,含馬兜鈴酸(aristolochic acid,AA)成分的中草藥所致的腎損害-馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy,AAN)已越來越受到國內(nèi)外學者的重視。動物實驗和臨床病理資料已證實AAN病理主要表現(xiàn)為進行性腎小管間質(zhì)纖維化(renaltubulointerstitial fibrosis,RIF)。由于AAN比一般慢性間質(zhì)性腎炎進展迅速,數(shù)月或1-2年內(nèi)即可發(fā)展

2、為終末期腎功能衰竭,預后極差,危害較大,因此探討AAN的發(fā)生機制及并設(shè)計相應的防治方法尤為重要,由此產(chǎn)生的新認識和治療藥物將為臨床提高AAN防治水平提供重要的幫助。
　　 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7,BMP-7),也被稱之為成骨蛋白-1(Osteogenic Protein-1,OP-1),屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factorβ,TFG-β)超

3、家族中的一個亞群。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BMP-7在腎發(fā)育和多種腎疾病模型中(單側(cè)輸尿管梗阻腎模型、腎缺血模型、糖尿病腎病模型、IgA腎病模型等)發(fā)揮重要的抗損傷作用,但BMP-7能否保護AA對腎小管損傷尚不清楚。
　　 本課題通過建立AAN的體外細胞損傷模型,研究AA所致腎小管損傷的機制并探討B(tài)MP-7的可能保護機制。
　　 方法:本課題分2部分進行探討。
　　 第一部分:觀察馬兜鈴酸對人腎小管上皮細胞(Human re

4、nal tubular epithelial cells,HK-2)的損傷作用,篩選出AA對HK-2細胞的最佳致傷濃度。實驗分組如下:正常對照組(僅加入培養(yǎng)液),AA30組(AA的終濃度30μmol/L),AA60組(AA的終濃度60μmol/L),AA120組(AA的終濃度120μmol/L)。
　　 第二部分:探討B(tài)MP-7對馬兜鈴酸致HK-2細胞損傷的保護作用。根據(jù)第一部分的研究得出AA對HK-2細胞的最佳致傷濃度是60μ

5、mol/L。實驗分組如下:正常對照組(僅加入培養(yǎng)液),AA60組(AA的終濃度60μmol/L),AA60+BMP500組(AA的終濃度60μmol/L,BMP-7的終濃度是500ng/ml),AA60+BMP1000組(AA的終濃度60μmol/L,BMP-7的終濃度是1000ng/ml)。
　　 細胞培養(yǎng)48h后,為了觀察AA引起的細胞損傷表現(xiàn)以及BMP-7是否有保護作用,進行以下指標的檢測。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化

6、,通過生化法測定細胞上清液中LDH的含量和CCK8檢測細胞增殖,流式細胞儀檢測細胞凋亡,Western blot檢測激活型Caspase-3的表達,免疫熒光染色檢測細胞α-SMA和E-cadherin的表達,ELISA測定細胞上清液中TGF-β1和Ⅲ型膠原的含量。旨在觀察AA對HK-2細胞增殖、凋亡、膜損傷及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)的影響,探討其可能機制及BM

7、P-7對AA所致HK-2細胞損傷的保護作用機制。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:
　　 1、正常對照組HK-2細胞呈現(xiàn)鵝卵石樣結(jié)構(gòu),AA30組中部分細胞伸長呈梭形,AA60組大多數(shù)細胞胞體拉長,呈現(xiàn)梭形,失去鵝卵石樣上皮細胞結(jié)構(gòu),AA120組中多數(shù)細胞聚縮、變圓,發(fā)生壞死。
　　 2、AA可引起HK-2細胞增殖抑制,凋亡增加,LDH含量增加,凋亡可能與激活型Caspase-3表達增多有關(guān)。
　　

8、3、低濃度(30,60μmol/L)的AA可使HK-2細胞E-cadherin表達減弱,α-SMA表達增強,TGF-β1和Ⅲ型膠原分泌增加。
　　 4、在60μmol/L濃度的AA作用下,HK-2細胞損傷表現(xiàn)典型,有明顯的EMT形態(tài)學改變,因此選用此濃度作為AA對HK-2細胞的最佳致傷濃度進行第二部分的實驗。
　　 第二部分:在AA60+BMP500組和AA60+BMP1000組中觀察到,與AA60組比較,細胞形態(tài)改變不

9、明顯,細胞增殖增加,凋亡率降低,激活型Caspase-3的表達及LDH釋放減少,TGF-β1及Ⅲ型膠原的分泌減少,且BMP-7濃度越高,上述表現(xiàn)越顯著。
　　 結(jié)論:
　　 1、AA可引起HK-2細胞增殖抑制,凋亡增加,凋亡可能與激活型Caspase-3表達增多有關(guān)。
　　 2、低濃度(30,60μmol/L)的AA可促使HK-2細胞發(fā)生EMT,且EMT發(fā)生可能與TGF-β1分泌增加有關(guān)。
　　 3、BM