骨髓干細胞移植對馬兜鈴酸腎病大鼠模型腎小管上皮細胞分化潛能及治療作用探討.pdf

1、目的：馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy，AAN)是由于服用含有馬兜鈴酸(chronic aristolochic acid，AA)的中草藥導致的腎損害疾病，病理改變主要為腎小管萎縮消失、腎小管基底膜增厚屈曲；腎間質(zhì)片狀或彌漫性纖維化；小動脈壁增厚、管腔狹窄；腎小球缺血性皺縮、硬化。多數(shù)為慢性AAN(chroilic adstolochicacid nephropathy，CAAN)，呈現(xiàn)典型的慢性

2、腎小管間質(zhì)腎病，而慢性腎臟疾病的進展是一個不可逆轉(zhuǎn)的過程，最終導致終末期腎衰竭。 目前CAAN的發(fā)病機制尚未十分清楚，所以缺乏統(tǒng)一可靠的治療方法，深入探討AAN的發(fā)生機制，尋找新的有效預防和治療措施，控制和延緩腎衰竭進展，是目前研究的重點之一。 近年來干細胞移植已成為醫(yī)學領域的研究熱點。研究證明，骨髓干細胞除向血液系統(tǒng)定系分化外，還可以跨系分化為其他系統(tǒng)有功能的組織成分，包括向腎組織細胞分化，這為難治性腎臟疾病(如CAA

3、N)的治療提供了新思路。本研究通過建立CAAN動物模型，并予以骨髓干細胞移植，旨在探討干細胞向CAAN腎臟細胞分化的潛能及對CAAN的治療作用，并進而推斷CAAN的發(fā)病機制。 本試驗從以下三個方面進行了研究：①骨髓源性干細胞向慢性馬兜鈴酸腎病大鼠腎小管上皮細胞分化潛能的研究；②干細胞移植對慢性馬兜鈴酸腎病大鼠的治療作用；③干細胞移植對慢性馬兜鈴酸腎病大鼠腎組織α-SMA、CK18、TGF-β1、HGF表達的影響。 材料與

4、方法： 第一部分：雌性Wistar大鼠37只，隨機分為2組：①移植組(n=16只)，予以關(guān)木通煎劑灌胃(20g．kg<'-1>.d<'-1>，相當于10ml．kg<'-1>．d<'-1>)，分兩次給予，每周連續(xù)用藥5天，共12周。然后予以亞致死劑量X線照射后經(jīng)尾靜脈注射途徑移植同系雄性Wistar大鼠骨髓干細胞(骨髓干細胞1×10<'8>個/只，0.35ml/只)。于尾靜脈注射干細胞后第30天、第60天分別處死8只大鼠。②非移植

5、組(n=21只)，予以關(guān)木通煎劑灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相當于10m1．kg<'-1>．d<'-1>)，分兩次給予，每周連續(xù)用藥5天，共12周。然后予以尾靜脈注射等量生理鹽水(0.35ml/只)，于尾靜脈注射生理鹽水后第30天、第60天分別處死8只大鼠。其中隨機選取5只大鼠于注射生理鹽水前與移植組一起接受x線照射，并于第30天時處死5只大鼠。另設正常對照組(n=5只)：均為雄性Wistar大鼠，自由進食水，實驗結(jié)束時

6、全部處死。大鼠在處死時留取腎組織標本。本部分用連續(xù)切片做免疫熒光(IF)染色結(jié)合Y染色體熒光原位雜交(Y-FISH)方法，主要觀察移植組大鼠腎組織中骨髓源性干細胞的分化情況。非移植組(第30天時)，腎組織切片做HE染色觀察X線照射對腎組織病理改變的影響。 第二部分：雌性Wistar大鼠40只，隨機分為3組：①移植組(n=16只)，予以關(guān)木通煎劑灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相當于10m1．kg<'-1>．d<'-1

7、>)，分兩次給予，每周連續(xù)用藥5天，共12周。然后予以亞致死劑量X線照射后經(jīng)尾靜脈注射途徑移植同系雄性Wistar大鼠骨髓干細胞(骨髓干細胞1×10<'8>個/只，0.35ml/只)。于尾靜脈注射干細胞后第30天、第60天分別處死8只大鼠。②非移植組(n=16只)，予以關(guān)木通煎劑灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相當于10m1．kg<'-1>．d<'-1>)，分兩次給予，每周連續(xù)用藥5天，共12周。然后予以尾靜脈注射等量生理鹽

8、水(0.35ml/只)。于尾靜脈注射生理鹽水后第30天、第60天分別處死8只大鼠。③正常對照組(n=8只)，予以飲用水10ml．kg<'-1>．d<'-1>(分兩次給予)灌胃，每周連續(xù)5天，共12周，然后經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水(0.35ml/只)。并于尾靜脈注射生理鹽水后第60天處死8只大鼠。大鼠在處死前留尿測24小時尿蛋白定量、處死時留取血、尿標本。做血尿素氮、肌酐、血紅蛋白、尿β<,2>-MG、尿NAG檢測。觀察各組大鼠臨床相關(guān)指

9、標的動態(tài)變化。 第三部分：雌性Wistar大鼠40只，隨機分為3組：①移植組(n=16只)，予以關(guān)木通煎劑灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相當于10ml．kg<'-1>．d<'-1>)，分兩次給予，每周連續(xù)用藥5天，共12周。然后予以亞致死劑量X線照射后經(jīng)尾靜脈注射途徑移植同系雄性Wistar大鼠骨髓干細胞(骨髓干細胞1×10<'8>個/只，0.35ml/只)。于尾靜脈注射干細胞后第30天、第60天分別處死8只大鼠。

10、②非移植組(n=16只)，予以關(guān)木通煎劑灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相當于10ml．kg<'-1>．d<'-1>)，分兩次給予，每周連續(xù)用藥5天，共12周。然后予以尾靜脈注射等量生理鹽水(0.35ml/只)。于尾靜脈注射生理鹽水后第30天、第60天分別處死8只大鼠。③正常對照組(n=8只)，予以飲用水10ml．kg<'-1>．d<'-1>(分兩次給予)灌胃，每周連續(xù)5天，共12周，然后經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水(0.35m

11、l/只)。并于尾靜脈注射生理鹽水后第60天處死8只大鼠。大鼠在處死時留取腎組織標本。做HE及Masson染色，光鏡觀察干細胞移植前后CAAN大鼠腎臟組織形態(tài)學變化情況；電鏡觀察腎小管上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)變化；應用免疫組化方法檢測移植前后腎臟αc-SMA、CK18、 TGF-β<,1>和HGF表達的變化；RT-PCR方法檢測移植前后α-SMA、CK18、TGF-β<,1>和HGF的mRNA表達變化；Western blot技術(shù)檢測移植前后α

12、-SMA、CK18、FGF-β<,1>和HGF的蛋白表達變化。數(shù)據(jù)處理：采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件分析處理，計量數(shù)據(jù)x±s表示，組間差異采用單因素方差分析，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 第一部分：①正常對照組：雄性大鼠腎組織切片經(jīng)Y-FISH檢測觀察到Y(jié)染色體陽性(Y<'+>，黃綠色熒光亮點)雜交細胞。②非移植組：雌性CAAN大鼠，生理鹽水注射后第30天及第60天腎組織切片經(jīng)Y-FISH檢測均未觀察到Y(jié)<'+>

13、雜交細胞。③移植組：在骨髓干細胞移植后第30天、第60天時，大鼠腎組織切片經(jīng)Y-FISH檢測亦觀察到Y(jié)<'+>雜交細胞，同時連續(xù)切片做免疫熒光染色檢測觀察到其表達腎小管上皮細胞的表型特征CKl8和RCA Ⅰ(CK18<'+>、RCA Ⅰ<'+>)。④非移植組(第30天時)經(jīng)X線照射和未照射大鼠腎組織切片做HE染色：結(jié)果未發(fā)現(xiàn)兩組大鼠形態(tài)結(jié)構(gòu)存在明顯差異，說明該劑量X線照射對CAAN腎臟無特殊影響。 第二部分：腎功能測定結(jié)果：非移

14、植組BUN、Cr逐漸升高，第30天、第60天時BUN值分別為19.25±4.26、25.04±6.5，與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義P<0.01；移植組BUN、Cr明顯降低，第30天、第60天時BUN值分別為11.47±3.19、9.71±3.74，與非移植組比較有統(tǒng)計學意義P<0.01但仍高于正常對照組高，差異有統(tǒng)計學意義P<0.01。 第三部分：腎臟病理學檢查發(fā)現(xiàn)非移植組損傷嚴重、腎間質(zhì)纖維化明顯，腎間質(zhì)纖維化面積于第30天、

15、第60天分別為0.20±0.016、0.25±0.02，經(jīng)干細胞移植后損傷減輕、無明顯纖維化，纖維化面積分別為0.13±0.006、0.12±0.005，與正常對照組和移植組相比，非移植組大鼠腎間質(zhì)纖維化面積明顯增加P<0.01；電鏡觀察移植組腎小管上皮細胞超微結(jié)構(gòu)較對照組明顯改善。 結(jié)論： 本研究結(jié)果表明： (1)移植組(第30天、第60天)和正常對照組(雄性)大鼠腎組織切片經(jīng)Y-FISH檢測均觀察到Y(jié)染色體陽

16、性雜交細胞，而非移植組雌性CAAN大鼠腎組織切片經(jīng)Y-FISH檢測未觀察到Y(jié)<'+>細胞；同時，移植組大鼠腎組織切片經(jīng)免疫熒光檢測觀察到這些Y<'+>細胞部分表達腎小管上皮細胞的表型特征CK18和RCA Ⅰ(CK8<'+>、RCA Ⅰ<'+>)。證明骨髓源性干細胞具有向CAAN大鼠腎臟小管上皮細胞分化的潛能。 (2)骨髓干細胞移植可以明顯改善CAAN大鼠的腎功能、提高血紅蛋白水平、減少24小時尿蛋白和β<,2>-MG的丟失、降低

17、尿NAG含量。說明骨髓干細胞移植對CAAN有治療作用。這不僅給CAAN的治療開拓干細胞治療的新途徑，而且也為其他原因所致的腎衰竭的治療帶來新的希望。 (3)骨髓干細胞移植能明顯減輕CAAN大鼠腎臟病理損害，減輕腎間質(zhì)纖維化；降低腎臟α-SMA、TGF-β1蛋白和mRNA表達，提高腎臟CK18、HGF蛋白和mRNA的表達；從而在細胞和細胞因子水平，證明骨髓干細胞移植能減輕腎損害和腎間質(zhì)纖維化。這將為CAAN甚至其他腎小管間質(zhì)纖維化