AM12質(zhì)粒對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過(guò)AM12質(zhì)粒(含HBV3.2kb全基因組)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，觀察HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、凋亡、Fas表達(dá)及對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)分泌的影響，初步探討乙型肝炎病毒(HBV)在乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎(HBV-GN)腎損傷中的作用及機(jī)理，為臨床預(yù)防或/和治療HBV-GN提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。 方法：將HK-2細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至80％-90％融合，0.25％胰酶消化，以1×106/ml

2、傳代于細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2、95％空氣的條件下貼壁并培養(yǎng)至80％-90％融合后，以含HBV3.2 kb全基因組的AM12質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞為轉(zhuǎn)染組，以正常HK-2細(xì)胞作為陰性對(duì)照組、HK-2細(xì)胞與慢性乙肝患者血清共同培養(yǎng)作為陽(yáng)性對(duì)照組： 1．將HK-2細(xì)胞以1×106/ml傳代于24孔培養(yǎng)板中，以AM12質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，37℃、5％CO2、95％空氣的條件下繼續(xù)培養(yǎng)5天，采用時(shí)間分辨免疫熒光法檢測(cè)HBsAg

3、、HBeAg的表達(dá)； 2．將HK-2細(xì)胞以1×106/ml傳代于6孔培養(yǎng)板中，分對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組，以37℃、5％CO2、95％空氣的條件繼續(xù)培養(yǎng)3天后，以0.25％胰酶消化收集細(xì)胞，70％冷酒精固定24小時(shí)，用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度約1×106/ml，碘化丙啶(PI)避光染色1小時(shí)，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)HK-2凋亡情況； 3．將HK-2細(xì)胞以1×106/ml傳代于6孔培養(yǎng)板中，分對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組，以37℃、5％CO2、95

4、％空氣的條件繼續(xù)培養(yǎng)3天后，以0.25％胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度約1×106/ml，加入CD95-FITC鼠抗人單克隆抗體，室溫避光反應(yīng)20分鐘，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)HK-2 Fas表達(dá)情況； 4．將HK-2細(xì)胞以1×106/ml傳代于24孔培養(yǎng)板中，分對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組，以37℃、5％CO2、95％空氣的條件繼續(xù)培養(yǎng)3天后，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)上清液中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的濃度。于

5、波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取標(biāo)準(zhǔn)品OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品OD值與標(biāo)準(zhǔn)品0點(diǎn)OD值的比率為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，采用SPSS軟件擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)本的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其濃度值； 5．將HK-2細(xì)胞以1×106/ml傳代于預(yù)置玻片的6孔培養(yǎng)板中，分轉(zhuǎn)染組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組，以37℃、5％CO2、95％空氣的條件繼續(xù)培養(yǎng)3天后，取出玻片進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)角蛋白(CK)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)，

6、胞漿呈棕黃色為陽(yáng)性，并對(duì)染色后細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡下觀察，攝片，Image-Pro Plus軟件分析平均光密度，進(jìn)行相對(duì)定量。 結(jié)果： 1．轉(zhuǎn)染5天后可在其中一孔中檢測(cè)到乙肝抗原的表達(dá)，其HBsAg的熒光強(qiáng)度為73245，濃度為5.377 ng/ml；HBeAg的熒光強(qiáng)度為92746，濃度為0.890NCU/ml。 2．對(duì)照組HK-2凋亡率為1.03±0.09％，轉(zhuǎn)染組為1.49±0.02％，轉(zhuǎn)染組凋亡率高于對(duì)照組(P

7、<0.05)。 3．對(duì)照組HK-2Fas表達(dá)率為6.58±0.65％，轉(zhuǎn)染組為10.09±2.34％，轉(zhuǎn)染組HK-2 Fas表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。 4．陰性對(duì)照組TGF-β1水平為210.28±47.21pg/ml，轉(zhuǎn)染組為283.85±61.12 pg/ml，轉(zhuǎn)染組TGF-β1水平高于對(duì)照組(P<0.05)。 5．陰性對(duì)照組HK-2角蛋白表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組呈弱陽(yáng)性，平均光密度值分別為

8、0.078±0.017、0.068±0.029、0.069±0.035，u值分別為12.000(陰性組vs.轉(zhuǎn)染組)、4.067(轉(zhuǎn)染組vs.陽(yáng)性組)，差異均有顯著性(P<0.05)；陰性對(duì)照組α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)陰性，陽(yáng)性對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組呈強(qiáng)陽(yáng)性，平均光密度值分別為0.034±0.011、0.122±0.031、0.094±0.037，u值分別為26.914(陰性組vs.轉(zhuǎn)染組)、10.045(轉(zhuǎn)染組vs.陽(yáng)性組)，各組間比較差異有顯

9、著性(P<0.05)。 結(jié)論： 1．含3.2kb全基因組的HBV-DNA質(zhì)?？赊D(zhuǎn)染人腎小管上皮細(xì)胞，并引起腎小管上皮細(xì)胞損傷。 2．HBV-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細(xì)胞可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加，F(xiàn)as表達(dá)升高。 3．HBV-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細(xì)胞可引起TGF-β1分泌增加。 4．HBV-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細(xì)胞可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。 故推測(cè)乙肝病毒可在腎小管上皮細(xì)