HBx介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）對(duì)腎小管上皮細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的影響及TLR4在其中的作用。
　　方法:（1）選取6周齡C57BL/6J-TgN轉(zhuǎn)基因小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、干預(yù)組，另取C57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照組，干預(yù)組于小鼠第8周齡尾靜脈注射TLR4 shRNA慢病毒，每4周注射一次。分別于第8、12、16、20、24周齡采集小鼠血液、尿液標(biāo)本，于第24周齡處死小鼠，觀察小鼠腎功能及腎組織病理變化，并采用

2、免疫組化及免疫熒光觀察腎組織HBx、TLR4表達(dá)，巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞浸潤情況及腎小管上皮細(xì)胞免疫分子表達(dá)情況。（2）構(gòu)建pcDNA3.1-myc-HBx過表達(dá)質(zhì)粒及TLR4 shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人近端腎小管上皮細(xì)胞系（HK-2），Western blot檢測HBx、TLR4的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)觀察HK-2細(xì)胞MHC-II、CD40表達(dá)；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）檢測共培養(yǎng)后流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T細(xì)胞CD40L的表達(dá)及CD4+T細(xì)胞增殖的能

3、力；ELISA測定MLR上清中 IFN-γ、IL-4含量；用上述HK-2細(xì)胞的培養(yǎng)上清去刺激巨噬細(xì)胞，檢測巨噬細(xì)胞粘附性，ELISA及Real-time PCR檢測MCP-1、TNF-α、IL-1β表達(dá)。（3）采用Western blot檢測HK-2細(xì)胞TLR4下游信號(hào)通路MyD88、IRAK4、TRAF6、TRAM、TRIF、IRF3、p-IRF3的表達(dá)，激光共聚焦檢測p-IRF3、NF-κB p65的定位，ELISA檢測炎癥因子TN

4、F-α、IL-6表達(dá)及IFN-β表達(dá)；經(jīng)MyD88抑制劑干預(yù)后，檢測HK-2細(xì)胞MHC-II、 CD40表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:（1）和對(duì)照組相比，C57BL/6J-TgN轉(zhuǎn)基因小鼠自16周齡起24 h尿蛋白增加，第24周齡血肌酐顯著增加，腎功能惡化，腎小球腎小管均有不同程度損傷。腎小管上皮細(xì)胞可見HBx及TLR4的表達(dá)，腎小管間質(zhì)T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤明顯，且腎小管上皮細(xì)胞MHC-II、CD40表達(dá)上調(diào)，浸潤的T細(xì)胞CD40L表達(dá)

5、增加；經(jīng)TLR4 shRNA干預(yù)后，尿蛋白減少，腎功能緩解，腎小管上皮細(xì)胞TLR4表達(dá)降低，浸潤的T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞減少，且腎小管上皮細(xì)胞MHC-II、CD40的表達(dá)及浸潤的T細(xì)胞CD40L表達(dá)都有所降低。（2）轉(zhuǎn)染HBx基因的HK-2細(xì)胞TLR4、MHC II、CD40表達(dá)均上調(diào)，體外刺激T細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，T細(xì)胞CD40L表達(dá)增加，且T細(xì)胞分泌的IFN-γ/IL-4比值增高，體外刺激巨噬細(xì)胞活化，粘附性增強(qiáng)，分泌趨化因子MCP-1及炎

6、癥因子TNF-α、IL-1β增加；經(jīng)TLR4 shRNA干預(yù)后，HK-2細(xì)胞TLR4、 MHC-II、 CD40表達(dá)均下調(diào)，且刺激 T細(xì)胞增殖能力減弱，T細(xì)胞CD40L水平下降，IFN-γ/IL-4比值下降，刺激巨噬細(xì)胞活化能力亦減弱，巨噬細(xì)胞粘附性降低，分泌趨化因子MCP-1及炎癥因子TNF-α、IL-1β減少。（3）轉(zhuǎn)染HBx基因的HK-2細(xì)胞中TLR4下游MyD88依賴信號(hào)通路分子MyD88、IRAK4、TRAF6表達(dá)均增加，NF

7、-κB p65入核亦增加，炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)增加；非MyD88依賴信號(hào)通路分子TRAM、TRIF、IRF3、p-IRF3的表達(dá)亦增加，p-IRF3入核，IFN-β表達(dá)增加。使用MyD88抑制劑抑制MyD88信號(hào)通路后，HK-2細(xì)胞MHC-II、CD40表達(dá)均明顯下調(diào)。
　　結(jié)論:HBx可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞MHC-II及共刺激分子表達(dá)，發(fā)揮抗原提呈細(xì)胞樣功能，進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞的激活、分化，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化，可能由此參