膿毒癥過程中細胞外組蛋白對腎小管上皮細胞凋亡的作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是膿毒癥發(fā)展過程中最常見且最嚴重的并發(fā)癥之一。與非膿毒癥AKI不同，膿毒癥AKI最主要的致病因素是腎小管上皮細胞凋亡。有研究指出細胞外組蛋白參與了AKI的發(fā)病過程，而關于膿毒癥的研究則指出細胞外組蛋白是導致膿毒癥患者死亡的主要因素。因此，本研究將在前期實驗和文獻分析的基礎上探索細胞外組蛋白在膿毒癥過程中引起AKI的機制。
　　研究目的:
　　1

2、.細胞外組蛋白是否可以誘導腎小管上皮細胞凋亡;
　　2.細胞外組蛋白是否通過線粒體途徑誘導腎小管上皮細胞凋亡。
　　研究方法:
　　體外實驗:
　　1.細胞外組蛋白對HK-2細胞凋亡的誘導作用
　　將50μg/ml組蛋白以等體積培養(yǎng)基作為對照（下同）與人腎小管上皮細胞（human kidney-2cell，HK-2）細胞株共培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)2h、4h和6h時用沛式細胞儀檢測HK-2細胞的凋亡率，明確細胞外組

3、蛋白的最佳培養(yǎng)時間（本實驗為4h）后換不同濃度（25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）的組蛋白與HK-2細胞共培養(yǎng)，用流式細胞儀檢測凋亡率并明確細胞外組蛋白作用是否存在濃度依賴性。
　　2.細胞外組蛋白通過線粒體途徑誘導HK-2細胞凋亡
　　將不同濃度的組蛋白（25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）與HK-2細胞共培養(yǎng)，4h后進行羅丹明123(Rhodamine123，Rho123)染色、提取細胞蛋白

4、，流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化情況;Western Blot法檢測線粒體膜蛋白Bcl-2、MAPK p38磷酸化蛋白(p-p38)、Caspase-9及Caspase-3蛋白的表達量。
　　體內實驗:
　　將不同濃度（50mg/kg、100mg/kg）的組蛋白以等量生理鹽水作為對照，經尾靜脈注射至BALB/c小鼠體內，觀察6h，眼眶取血后處死，取出小鼠腎臟并去除腎蒂及包膜。部分腎組織研磨后制成細胞懸液用流式細胞儀檢測細胞凋

5、亡;部分腎組織留作病理標本，行TUNEL染色;部分腎組織用于提取蛋白，Western Blot法檢測Bcl-2、MAPK p38磷酸化蛋白的表達情況。分離小鼠血清用于檢測血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及胱抑素C(Cys C)等腎功能指標。
　　數(shù)據分析方法
　　采用SPSS20.0軟件進行數(shù)據統(tǒng)計分析，分析結果用均數(shù)±標準差（(X)±S）表示。各組間均數(shù)差異顯著性的比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）表示;

6、各組間兩兩比較用2-tailed student's t檢驗表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。用Kaplan-Meier法進行生存分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　研究結果:
　　1.體外實驗結果
　　與對照組相比，各組蛋白濃度組HK-2細胞凋亡率明顯增高，存在顯著性差異(P＜0.01);MAPKp38磷酸化蛋白、Caspase-9及Caspase-3蛋白表達量增高，Bcl-2蛋白表達量降低，差異有統(tǒng)

7、計學意義(P＜0.05);各組蛋白濃度組線粒體膜電位較對照組明顯下降(P＜0.01)。
　　2.體內實驗結果
　　與對照組相比，組蛋白100mg/kg組小鼠累計生存率明顯降低(P=0.001)，50mg/kg組小鼠生存率無顯著差異(P=0.055);各組蛋白濃度組小鼠與對照組相比，腎臟細胞凋亡率增高、MAPKp38磷酸化蛋白表達量增高、Bcl-2蛋白表達量下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);組蛋白100mg/kg組小鼠