CUEDC2在腎間質(zhì)纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)建立纖維化模型來(lái)探討CUEDC2在腎纖維化中的作用及其可能的機(jī)制。
　?。ㄒ唬〤UEDC2蛋白對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠腎組織炎癥反應(yīng)的作用
　　目的:研究CUEDC2蛋白在單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織炎癥反應(yīng)中的作用。
　　方法:建立單側(cè)輸尿管梗阻模型:清潔級(jí)balb/c小鼠30只（購(gòu)自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham-vector)、UUO組(uuo-vector)、CU

2、EDC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療組(uuo-cuedc2)，每組分別有10只小鼠。UUO組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療組均行單側(cè)輸尿管梗阻手術(shù)，即將右側(cè)輸尿管進(jìn)行游離并結(jié)扎離斷，而假手術(shù)組只游離右側(cè)輸尿管，不進(jìn)行結(jié)扎離斷。采用超聲微泡聯(lián)合穿膜肽技術(shù)分別在術(shù)前1天、術(shù)后1天及術(shù)后7天給三組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，假手術(shù)組和UUO組轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒，治療組轉(zhuǎn)染cuedc2質(zhì)粒。質(zhì)粒均經(jīng)由尾靜脈注入。于術(shù)后第7天和第14天分別處死小鼠，每組5只。留取組織標(biāo)本時(shí)，采集各組

3、小鼠血液，離心吸取上清，-80℃保存?zhèn)溆?。灌流沖洗，待腎臟變白后小心剝離右側(cè)腎臟，去除包膜，將腎組織分為不同小塊，留做免疫組化或用于提取組織蛋白。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)炎癥因子細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1，intercellular cell adhesion molecule1）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1，monocyte chemotactic protein1)、白介素-1（IL-1）、白介素-8(IL-

4、8)表達(dá);免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎組織單核/巨噬細(xì)胞表面抗原(CD68)及腎臟組織中CUEDC2蛋白的表達(dá);
　　結(jié)果:CUEDC2免疫組化結(jié)果顯示，UUO術(shù)后CUEDC2蛋白表達(dá)減少，經(jīng)過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，其表達(dá)增加(p＜0.05)。ELISA及CD68抗原免疫組化結(jié)果顯示，UUO模型組，炎癥因子ICAM1、MCP1、IL1、IL8及CD68抗原表達(dá)增加，隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，增多趨勢(shì)更加明顯(p＜0.05);治療組中炎癥因子表達(dá)和CD68抗原

5、表達(dá)下調(diào)，在各時(shí)間點(diǎn)均低于UUO組的表達(dá)。
　　小結(jié):CUEDC2蛋白可以抑制單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、減少炎癥因子在纖維化腎組織中的表達(dá)，減輕腎臟炎癥反應(yīng)，進(jìn)而可以抑制腎臟纖維化的發(fā)生。
　?。ǘ〤UEDC2在腎間質(zhì)纖維化中的作用及其可能機(jī)制
　　(1)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　目的:探討CUEDC2蛋白在腎小管上皮細(xì)胞（HK2細(xì)胞）EMT中的作用及可能機(jī)制。
　　方法:5ng/ml TGF-β1刺激HK2細(xì)胞，共6

6、個(gè)時(shí)間點(diǎn)，誘導(dǎo)其EMT模型形成。用試劑盒提取vector和cuedc2目標(biāo)質(zhì)粒，制備慢病毒，用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)目標(biāo)質(zhì)粒的HK2細(xì)胞系，之后同樣用TGF-β1來(lái)刺激細(xì)胞，調(diào)整為刺激4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。Western免疫印跡檢測(cè)CUEDC2、Fibronectin、E-cadherin、Vimentin、p-smad2、p-smad3和smad2、smad3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:TGF-β1刺激HK2細(xì)胞，使其E-cadherin

7、蛋白表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)ibronectin蛋白表達(dá)上調(diào)，隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)，這種變化趨勢(shì)愈加明顯，表明TGF-β誘導(dǎo)的EMT模型已經(jīng)成功建立，此時(shí)，CUEDC2蛋白隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸下調(diào)。TGF-β1分別刺激過(guò)表達(dá)vector及cuedc2的HK2細(xì)胞，CUEDC2蛋白表達(dá)在穩(wěn)定過(guò)表達(dá)組較對(duì)照組明顯增加，表明穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功。此時(shí)，與對(duì)照組相比，CUEDC2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)組中，在刺激的各時(shí)間點(diǎn)，E-cadherin蛋白表達(dá)增加，F(xiàn)ib

8、ronectin、Vimentin蛋白表達(dá)下降，p-smad2和p-smad3蛋白表達(dá)減少。
　　小結(jié):CUEDC2蛋白在TGF-β誘導(dǎo)的EMT中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)CUEDC2可以減少間質(zhì)表型蛋白表達(dá)，增加上皮表型蛋白表達(dá)，抑制smad2和smad3蛋白的磷酸化表達(dá)，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，CUEDC2可能參與了EMT的負(fù)性調(diào)節(jié)過(guò)程。
　　(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　目的:探討CUEDC2蛋白在梗阻性腎病對(duì)間質(zhì)纖維化的影響

9、及其可能的機(jī)制。
　　方法:UUO模型建立及組織標(biāo)本收集，同上。HE及Masson染色觀察腎臟病理改變，Western Blot用于檢測(cè)腎組織中CUEDC2、Fibronectin、E-cadherin、p-smad2、p-smad3等蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:CUEDC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療組，UUO術(shù)后7d及14d，腎組織的小管變性壞死程度、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化改變程度較UUO組明顯減輕，腎間質(zhì)的藍(lán)染面積與UUO組相比顯著降低。

10、經(jīng)CUEDC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療后，CUEDC2蛋白表達(dá)上調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)量增加，F(xiàn)ibronectin、CollagenⅠ、p-smad2、p-smad3蛋白表達(dá)量降低。
　　小結(jié):CUEDC2在UUO腎纖維化中，可以減輕腎小管損害程度，減少間質(zhì)膠原的沉積，抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成，抑制p-smad2和p-smad3蛋白的表達(dá)，抑制腎間質(zhì)纖維化。
　　結(jié)論:CUEDC2蛋白在細(xì)胞EMT模型和動(dòng)物UUO模型中均表達(dá)下調(diào)，