組織醛固酮在腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 腎間質(zhì)纖維化的慢性進(jìn)展目前尚無(wú)有效控制措施。因此，尋找腎間質(zhì)纖維化致病因子以及針對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究方興未艾。醛固酮(aldosteroneALDO)作為調(diào)節(jié)機(jī)體水鹽代謝平衡的一種內(nèi)分泌激素已為人熟知。近年來(lái)，醛固酮與臟器纖維化的研究又取得了突破性進(jìn)展。研究證實(shí)，醛固酮可以作為獨(dú)立致病因子促進(jìn)心臟和血管纖維化的發(fā)生和發(fā)展；此外，腦組織、心臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞等腎上腺外組織也證實(shí)具有合成醛固酮的能力，這種局部產(chǎn)生的醛固酮被命名

2、為組織醛固酮(localaldosterone)。目前，醛固酮致臟器纖維化的發(fā)病機(jī)制已成為多學(xué)科的研究熱點(diǎn)，同時(shí)，分子生物學(xué)研究方法的進(jìn)步使疾病發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特征受到普遍關(guān)注。迄今為止，對(duì)醛固酮在腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程中的致病機(jī)制及該病理機(jī)制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚知之甚少。擬利用體外細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行深入研究。 研究目的一.觀察腎小管上皮細(xì)胞系(HKC)是否具有合成組織醛固酮的能力并觀察內(nèi)皮素-1是否可以促進(jìn)該細(xì)胞合成醛

3、固酮。 二.首先觀察外源性及內(nèi)源性醛固酮對(duì)體外培養(yǎng)的HKC合成致腎間質(zhì)纖維化致病因子TGF-β1的影響；然后觀察被外源性醛固酮活化的HKC對(duì)hRIFs產(chǎn)生COL-Ⅰ的影響。 三.觀察MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑各支通路是否介導(dǎo)醛固酮促進(jìn)HKC產(chǎn)生TGF-β1的作用。 研究方法一.體外培養(yǎng)的HKC進(jìn)行試驗(yàn)，放射免疫方法檢測(cè)。(1)刺激試驗(yàn)：觀察HKC細(xì)胞受不同濃度和不同作用時(shí)間的ET-1刺激后，ALDO及血管緊張素Ⅱ(An

4、gⅡ)生成量的變化。(2)抑制試驗(yàn)：固定ALDO刺激條件，觀察不同濃度和不同作用時(shí)間的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)對(duì)HKC生成ALDO及AngⅡ的影響。 二.采用體外細(xì)胞培養(yǎng)及共培養(yǎng)進(jìn)行試驗(yàn)。(1)不同濃度及不同作用時(shí)間的外源性ALDO刺激HKC，逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)。(2)不同濃度及不同作用時(shí)間的安體舒通與內(nèi)皮素-1(

5、ET-1)共同刺激HKC，同上檢測(cè)TGF-β1mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)。(3)用外源性ALDO活化的HKC與hRIFs共培養(yǎng)(培養(yǎng)液中加或不加抗TGF-β1抗體)，ELISA方法檢測(cè)hRIFs的ColⅠ合成量。 三.體外培養(yǎng)的HKC進(jìn)行試驗(yàn)，(1)用不同濃度MAPK各支通路的特異性阻滯劑預(yù)孵育細(xì)胞，再以醛固酮刺激HKC，ELISA方法檢測(cè)TGF-β1合成量出現(xiàn)的變化。(2)用不同濃度及不同作用時(shí)間的外源性ALDO刺激HKC，ELIS

6、A方法檢測(cè)MAPK途徑各支通路磷酸化程度的改變。(3)用10-6mol/L的的安體舒通預(yù)孵育細(xì)胞2h，再以10-7mol/L醛固酮刺激HKC2h，觀察MAPK各支通路磷酸化程度的改變。研究結(jié)果 一.(1)未加任何刺激的HKC細(xì)胞能產(chǎn)生基礎(chǔ)量ALDO及AngⅡ。ET-1刺激后ALDO及AngⅡ的生成量均呈劑量依賴及時(shí)間依賴性增加，10-9及10-7mol/LET-1刺激48h后ALDO及AngⅡ的生成量顯著高于0mol/LET-1

7、組(P＜0.05或0.01)；10-7mol/L的ET-1刺激12h、24h及48h后ALDO及AngⅡ的生成量也顯著高于Oh組(P＜0.05或0.01)。 (2)用10-7mol/LET-1與不同濃度的ACEI共同孵育HKC細(xì)胞48h，結(jié)果10-9、10-7及10-5mol/L的ACEI能使AngⅡ及ALDO生成量顯著減少(與0mol/LACEI組比較P＜0.01)，但是，此濃度的ACEI雖能完全阻斷AngⅡ生成，卻未能完全阻

8、斷ALDO生成；用10-7mol/LET-1與10-5mol/LACEI共同孵育HKC細(xì)胞，并在不同時(shí)間段進(jìn)行觀察，結(jié)果6h及12h時(shí)AngⅡ及ALDO的合成均被完全阻斷(與0h比較P＞0.05)，但是24h及48h時(shí)ACEI雖能完全阻斷AngⅡ生成，卻不能完全阻斷ALDO生成。 二.(1)外源性ALDO使TGF-β1表達(dá)呈劑量依賴及時(shí)間依賴性增加。10-9及10-7mol/LALDO刺激組(mRNA水平作用12h、蛋白質(zhì)水平作

9、用48h)TGF-β1表達(dá)量較0mol/LALDO組顯著升高(P＜0.05或0.01)；10-7mol/LALDO刺激不同時(shí)間后(mRNA水平為8h、12h及16h，蛋白質(zhì)水平為12h、24h及48h)，TGF-β1表達(dá)量顯著高于0h組(P＜0.05或0.01)。 (2)安體舒通使TGF-β1表達(dá)呈劑量及時(shí)間依賴性減少。10-9、10-7mol/L安體舒通組(mRNA水平作用12h、蛋白質(zhì)水平作用作用48h)TGF-β1表達(dá)量較

10、0mol/L安體舒通組顯著減少(P＜0.05或P＜0.01)。10-9mol/LET-1加10-7mol/L安體舒通與單用10-9mol/LET-1刺激不同時(shí)間后(mRNA水平在12、16h，蛋白質(zhì)水平在24、48h)，兩組間TGF-β1表達(dá)出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05或0.01)。(3)10-7mol/LALDO刺激HKC12h活化細(xì)胞后，再與hRIFs共培養(yǎng)48h，hRIFs對(duì)ColⅠ的合成量顯著增多(P＜0.01)；1.0、2.0

11、μg/ml抗TGF-β1抗體能部分抑制此反應(yīng)(P＜0.05)。 三.(1)15μmol/L及25μmol/L的ERK通路抑制劑(U0126)可以使TGF-β1合成量顯著性減低(P＜0.05)，其余兩條途徑的抑制劑(SP600125、SB203580)未使TGF-β1合成量顯著性減低(P＞0.05)。 (2)10-7mol/LALDO刺激30min后，HKC細(xì)胞中磷酸化ERK開(kāi)始顯著性增加(P＜0.05)，時(shí)間延長(zhǎng)至2h后

12、ERK磷酸化達(dá)到高峰，此后逐漸減低，至6h時(shí)磷酸化程度與0h無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而JNK和p38兩條途徑的磷酸化均未隨著醛固酮刺激時(shí)間延長(zhǎng)而出現(xiàn)顯著性增加(P＞0.05)；不同濃度醛固酮對(duì)HKC刺激2h后，10-9、10-7mol/L組磷酸化ERK較0mol/L組出現(xiàn)顯著性增加(P＜0.01)，10-11mol/L組磷酸化ERK較0mol/L組未出現(xiàn)顯著性增加(P＜0.05)；不同濃度的醛固酮均未使JNK和p38兩條途徑磷酸化

13、程度出現(xiàn)顯著性增加(P＞0.05)。對(duì)相應(yīng)濃度醛固酮刺激下ERK的磷酸化水平與TGF-β1合成量之間具有顯著相關(guān)性(R=0.793，P＜0.01)。 (3)10-7mol/L醛固酮加10-6mol/L安體舒通刺激組磷酸化較僅使用醛固酮刺激組出現(xiàn)顯著性減低(P＜0.05)，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。JNK及p38磷酸化程度均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論一.人近端腎小管上皮細(xì)胞具有合成組織ALDO的能