肥大細(xì)胞在糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病腎臟疾病(Diabetic kidney disease，DKD)已成為終末期腎功能衰竭的最重要原因之一。DKD早期可出現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化，且不依賴(lài)腎小球病變直接加速腎功能的惡化，但其機(jī)制復(fù)雜。研究腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)理、靶向阻斷參與纖維化的細(xì)胞及信號(hào)通路，延緩DKD腎小管間質(zhì)纖維化、阻止腎功能的進(jìn)展已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。
　　 以往認(rèn)為DKD是一種非炎癥性疾病，近年來(lái)關(guān)于炎癥細(xì)胞及炎癥因子在DKD腎間質(zhì)纖維化中的作用越來(lái)

2、越受到重視，而肥大細(xì)胞作為一種重要的炎癥細(xì)胞也逐漸被關(guān)注。肥大細(xì)胞起源于骨髓CD34+多能祖細(xì)胞，肥大細(xì)胞胞漿顆粒中富含炎癥介質(zhì)，大量研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞參與了許多慢性腎臟病的腎間質(zhì)纖維化。有研究報(bào)道DKD患者腎活檢組織中腎間質(zhì)肥大細(xì)胞表達(dá)明顯增加，并與腎間質(zhì)纖維化的程度及腎功能的進(jìn)展密切相關(guān)。但肥大細(xì)胞參與DKD腎間質(zhì)纖維化的具體作用機(jī)制及信號(hào)通路尚不完全清楚。
　　 SCF/c-Kit是促進(jìn)肥大細(xì)胞的募集及活化的信號(hào)通路，SCF

3、、c-Kit可在腎間質(zhì)細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)，而且SCF可促進(jìn)膠原的合成及細(xì)胞外基質(zhì)的聚集，其在DKD腎間質(zhì)纖維化中的作用有待進(jìn)一步研究。
　　 目的：
　　 本課題擬通過(guò)檢測(cè)DKD患者腎組織，同時(shí)建立DKD動(dòng)物模型，從三個(gè)方面進(jìn)行研究:1、檢測(cè)肥大細(xì)胞在DKD患者腎間質(zhì)的浸潤(rùn)情況及與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系;2.通過(guò)肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑——曲尼斯特干預(yù)，觀察肥大細(xì)胞對(duì)DKD大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用;3.通過(guò)曲尼斯特干預(yù)，探討肥

4、大細(xì)胞介導(dǎo)DKD腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制是否與阻斷SCF/c-kit有關(guān)。研究肥大細(xì)胞在DKD腎間質(zhì)纖維化中的作用及機(jī)制，為開(kāi)發(fā)研究延緩腎功能進(jìn)展的有效藥物提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.收集2010～2011年來(lái)我院腎內(nèi)科就診，并于我院腎臟病研究所行腎活檢，結(jié)合臨床及病理診斷為DKD患者共14例。同時(shí)選取7例診斷為微小病變的病例作為對(duì)照組，所選取的對(duì)照組腎組織病變輕微，未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及間質(zhì)纖維化。應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染

5、色檢測(cè)肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫組化檢測(cè)DKD腎組織及微小病變腎組織肥大細(xì)胞特異性標(biāo)志——C3aR的分布情況
　　 2.建立DKD大鼠模型:SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=6)、DKD模型組和曲尼斯特低劑量和高劑量治療組(n=24)。采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量STZ注射誘發(fā)SD大鼠DKD模型(STZ溶于0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.5)，對(duì)照組只注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液，72h后測(cè)定血糖和尿糖，血糖值＞16.7m

6、mol/L，尿糖值+++～++++者確定為糖尿病模型。成模后，曲尼斯特治療組予曲尼斯特(200mg/kg/d和400mg/kg/d)分2次灌胃。于第8周末處死大鼠，收集大鼠24小時(shí)尿液測(cè)24小時(shí)尿白蛋白排泄量，收集血測(cè)腎功能及血白蛋白，取部分腎組織置于4％中性甲醛溶液中固定，觀察各組之間腎臟病理學(xué)變化。采用免疫組化方法檢測(cè)腎組織C3aR、FN、 ColⅠ、SCF和c-kit表達(dá)以及分布情況，用Western blot及PCR方法檢測(cè)腎組

7、織FN、ColⅠ、SCF和c-kit蛋白及mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.DKD患者腎間質(zhì)肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)較微小病變患者明顯增加，并與腎間質(zhì)纖維化損傷及腎功能進(jìn)展密切相關(guān)。
　　 2.成功構(gòu)建DKD模型:72h測(cè)定血糖和尿糖，血糖值≥16.7mmol/L，尿糖值+++～++++，確定為糖尿病模型。8周末時(shí)，糖尿病大鼠的血糖顯著高于正常對(duì)照組，且出現(xiàn)了明顯的“三多一少”癥狀，檢測(cè)尿白蛋白明顯增高，Mas

8、son染色腎小管間質(zhì)出現(xiàn)明顯的膠原沉積，說(shuō)明DKD大鼠模型建立是成功的。正常腎組織腎小管間質(zhì)區(qū)域及髓質(zhì)部分偶可見(jiàn)肥大細(xì)胞，8周末糖尿病腎組織肥大細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加。
　　 3.與正常對(duì)照組比較，DKD模型組肥大細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，腎小管間質(zhì)膠原相對(duì)面積增加(P＜0.05)，腎小管間質(zhì)區(qū)域ColⅠ、FN的表達(dá)增加。肥大細(xì)胞阻斷劑-曲尼斯特能明顯抑制ColⅠ、FN的表達(dá)，肥大細(xì)胞浸潤(rùn)和ColⅠ、FN的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)。

9、>　　 4.正常大鼠腎小管及腎間質(zhì)可見(jiàn)少量SCF蛋白表達(dá)，未見(jiàn)明顯的c-Kit蛋白表達(dá)，DKD大鼠腎組織SCF、c-Kit蛋白及mRNA表達(dá)增加，曲尼斯特能抑制SCF、c-Kit mRNA及蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。腎組織SCF、c-kit蛋白的表達(dá)與腎組織肥大細(xì)胞浸潤(rùn)程度及腎小管間質(zhì)FN、col-Ⅰ蛋白的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)肥大細(xì)胞可能在DKD患者腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中起作用。