MicroRNA-27a在糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、近年許多研究揭示了microRNA(miRNA，微小RNA)在糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)進(jìn)展中的重要作用。已經(jīng)證實(shí)miR-27a在DN表達(dá)上調(diào)，但其調(diào)節(jié)腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)的具體機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動物實(shí)驗(yàn)及DN患者研究探討miR-27a/PPARγ軸在其中的作用及可能的分子機(jī)制，為腎纖維化的防治措施提供新的依據(jù)和途徑。

2、　　第一章高糖條件下NRK-52E細(xì)胞miR-27a表達(dá)的變化及對纖維化的影響
　　目的:
　　觀察高糖條件下NRK-52E細(xì)胞miR-27a表達(dá)的變化及對纖維化的影響。
　　方法:
　　將NRK-52E分Mannitol、NG、HG三組，分別用含甘露醇30mmol/L和含糖5mmol/L、30mmol/L的DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。qRT-PCR法檢測各組在不同時間點(diǎn)（12、36和72h）及含糖組在不同糖

3、濃度(5mmol/L、15mmol/L、30mmol/L)時miR-27a、PPARγ、TGF-β1、Smad3、CTGF、FN、ColⅠ的mRNA，Western blot檢測其蛋白表達(dá)，熒光素酶報告基因檢測PPARγ-3'UTR的熒光素酶活性。
　　結(jié)果:
　　HG組miR-27a及TGF-β1、p-Smad3、CTGF、FN、ColⅠ表達(dá)上調(diào)，PPARγ表達(dá)下調(diào)，且為miR-27a的直接靶基因。
　　結(jié)論:

4、>　　高糖增加miR-27a表達(dá)，后者通過抑制PPARγ而誘導(dǎo)NRK-52E纖維化。
　　第二章上調(diào)或下調(diào)表達(dá)miR-27a對高糖條件下NRK-52E纖維化的影響
　　目的:
　　探討上調(diào)或下調(diào)表達(dá)miR-27a對高糖條件下NRK-52E細(xì)胞纖維化的影響。
　　方法:
　　以HG組NRK-52E為研究對象，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源性miR-27a抑制劑(miR-27ai)、miR-27a類似物(miR-27

5、am)、PPARγ siRNA及相應(yīng)對照物瞬時轉(zhuǎn)染NEK-52E，PPARγ激動劑羅格列酮(Rosi.)及對照物預(yù)處理細(xì)胞，將其分九組:(1) miR-27ai和相應(yīng)對照組(miR-iNC);(2) miR-27am和相應(yīng)對照組(miR-NC);(3)PPARγsiRNA和相應(yīng)對照組(NT siRNA);(4)Rosi.和相應(yīng)對照組(DMSO);(5) PPARγ siRNA+miR-27ai組。qRT-PCR、Western blot

6、和間接細(xì)胞免疫熒光檢測PPARγ、TGF-β1、Smad3、CTGF、FN、ColⅠ的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　高糖條件下，miR-27am下調(diào)PPARγ表達(dá)，上調(diào)TGF-β1、p-Smad3、CTGF、FN、ColⅠ表達(dá)，miR-27ai則作用相反。PPARγsiRNA和miR-27ai共轉(zhuǎn)染，可增加PPARγ表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　PPARγ作為miR-27a的直接靶基因，通過抑制TGF-β1/S

7、mad3通路而減輕NRK-52E纖維化。
　　第三章 STZ糖尿病大鼠模型miR-27a表達(dá)的變化及對TIF的影響
　　目的:
　　觀察STZ糖尿病大鼠模型血漿和腎組織中miR-27a表達(dá)的變化及對TIF的影響。
　　方法:
　　STZ糖尿病大鼠腹腔注射miR-27ai或miR-27am后分6組:(1)正常對照組(NC);(2)糖尿病造模組(DM);(3)DM_ miR-27ai和相應(yīng)對照組(DM_miR-

8、iNC):(4) DM_miR-27am和相應(yīng)對照組(DM_ miR-NC)。持續(xù)干預(yù)至12周后處死。qRT-PCR檢測大鼠血漿及腎臟miR-27a，Western blot及免疫組化檢測腎組織PPARγ、TGF-β1、p-Smad3、CTGF、FN、ColⅠ的表達(dá);Masson三色染色觀察腎組織病理改變。大鼠Scr、BUN、尿NAG、UAER，UACR、Ccr等腎損害相關(guān)指標(biāo)均被分析。
　　結(jié)果:
　　STZ大鼠血漿及腎組

9、織miR-27a表達(dá)上調(diào)，抑制miR-27a能上調(diào)PPARγ，減輕TIF及降低腎損害相關(guān)指標(biāo)。激活miR-27a則結(jié)果相反。
　　結(jié)論:
　　miR-27a/PPARγ軸通過激活TGF-β1/Smad3信號啟動STZ糖尿病大鼠TIF進(jìn)程。
　　第四章 DN患者血漿miR-27a表達(dá)的變化及對TIF的影響
　　目的:
　　觀察DN患者血漿miR-27a表達(dá)的變化及對TIF的影響。
　　方法:
　　

10、選取行腎活檢的DN患者52例。免疫組化分析其腎組織PPARγ、TGF-β1、p-Smad3、CTGF、FN、ColⅠ的表達(dá)，Masson三色染色觀察TIF的病理改變。收集DN患者及健康志愿者血標(biāo)本各30例，qRT-PCR法檢測其血漿miR-27a，并分析其與24h尿蛋白定量、尿NAG、Scr及eGFR等腎損害相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　DN患者血漿miR-27a表達(dá)上調(diào)，且與Scr、24h尿蛋白定量及尿NAG呈正相關(guān)