MicroRNA-22靶向PTEN-AKT-mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬及糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的研究.pdf

1、目的：
　　PTEN與糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其具體機(jī)制還不十分清楚，本研究旨在探討miR-22是否通過(guò)靶向PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬和腎間質(zhì)纖維化，以期進(jìn)一步闡明DN腎纖維化的發(fā)病機(jī)制，為防治DN探尋新的有效靶點(diǎn)。
　　方法:
　?、俳⑻悄虿∧I病大鼠模型和高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）模型，通過(guò)Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)分子的表達(dá)。②在NRK-52E細(xì)胞中分別

2、加入自噬促進(jìn)劑雷帕霉素(100nM)或自噬抑制劑氯喹(40μM)，使用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞蛋白樣本，通過(guò)Western blot檢測(cè)LC3、P62、Col-IV蛋白的表達(dá)。③在糖尿病腎病大鼠模型中通過(guò)免疫組織化學(xué)、Western blot及Real-time PCR檢測(cè)PTEN的表達(dá)。④分別收集高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞24h和48h的蛋白樣本和RNA樣本，通過(guò)Western blot和Real-time PCR檢測(cè)PTEN

3、的表達(dá)。⑤在糖尿病腎病大鼠模型中通過(guò)Western blot檢測(cè)AKT、p-AKT(Thr308)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)的表達(dá)。⑥在糖尿病腎病大鼠模型和高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)miR-22的表達(dá)。⑦通過(guò)生物信息學(xué)軟件TargetScan和miRanda預(yù)測(cè)miR-22與PTEN mRNA3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)，并將包含該結(jié)合位點(diǎn)的PTEN mRNA3’UTR序列構(gòu)建到載體pmiR-r

4、eporter中，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)驗(yàn)證miR-22對(duì)PTEN的靶向調(diào)控。⑧在NRK-52E細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-22，使用低糖或高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48h后收集蛋白樣本，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-22mimics48h后細(xì)胞中PTEN、LC3、p62以及Col-IV蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　?、偬悄虿∧I病大鼠腎臟組織及高糖培養(yǎng)的NRK-52

5、E細(xì)胞中LC3表達(dá)明顯減少(P<0.05)，p62表達(dá)明顯增高。②在高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中加入雷帕霉素能明顯促進(jìn)LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)化、促進(jìn)p62的降解、減少Col-IV的表達(dá)。③腎臟組織中PTEN主要分于腎小管上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)，且糖尿病腎病大鼠腎臟組織中PTEN的蛋白和mRNA表達(dá)均明顯減少(P<0.05)。④高糖培養(yǎng)24h和48h的NRK-52E細(xì)胞中PTEN的蛋白和mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.05)。⑤糖尿病腎病大鼠

6、腎組織中p-AKT(Thr308)、p-mTOR(Ser2448)的表達(dá)明顯增多(P<0.01)。⑥糖尿病腎病大鼠模型和高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中miR-22的表達(dá)明顯增多(P<0.05)。⑦miR-22能靶向結(jié)合PTENmRNA3’UTR。⑧過(guò)表達(dá)miR-22能明顯降低PTEN和LC3的表達(dá)，促進(jìn)p62以及Col-IV的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　?、僭诟咛桥囵B(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中促進(jìn)自噬能明顯抑制細(xì)胞膠原的合成。②高糖培養(yǎng)的