食蟹猴Ⅰ型糖尿病模型早期腎損傷中腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)公布的數(shù)據(jù)，全球糖尿病患者數(shù)量預(yù)計(jì)在2035年將達(dá)到5.92億人，其中10％將發(fā)展為糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)。糖尿病腎病是糖尿病患者死亡率最高的并發(fā)癥之一，并且已成為誘發(fā)終末期腎臟病的主要原因。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，DN是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的首要病因，約占ESRD

2、的30％-40％。在我國(guó)，DN在ESRD中占16.4％，僅次于原發(fā)性腎小球腎炎。由于其存在復(fù)雜的代謝紊亂，初期癥狀不典型也很少能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)展到終末期腎臟病，往往比其他腎臟疾病的治療更加棘手。
　　糖尿病腎病的典型表現(xiàn)是細(xì)胞外基質(zhì)在腎小球和腎小管的過(guò)度沉積，引起腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。晚期鏡下可見(jiàn)腎小球基底膜增厚，系膜增生，毛細(xì)血管基底膜彌漫增厚，形成結(jié)節(jié)狀硬化（K-W結(jié)節(jié)），其中腎間質(zhì)纖維化被認(rèn)為是DN的主要病理特征之一。

3、目前大家基本認(rèn)同激活的肌成纖維細(xì)胞異常合成的細(xì)胞外基質(zhì)在腎小管間質(zhì)的過(guò)度積累是腎間質(zhì)纖維化的主要原因這一觀點(diǎn)，但對(duì)于激活的肌成纖維細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題仍存在諸多爭(zhēng)議。當(dāng)前研究認(rèn)為激活的肌成纖維細(xì)胞可能來(lái)有以下幾種來(lái)源:增殖的原位成纖維細(xì)胞，骨髓細(xì)胞分化來(lái)源的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化來(lái)源的成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)來(lái)源的成纖維細(xì)胞。但每種來(lái)源是否真實(shí)存在和所占

4、比例都存在爭(zhēng)論，其中激活的肌成纖維細(xì)胞是否可由小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來(lái)，是目前研究的熱點(diǎn)之一。
　　目前有關(guān)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與了糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化過(guò)程的研究主要是基于小鼠和大鼠糖尿病動(dòng)物模型，但由于嚙齒類(lèi)動(dòng)物與人類(lèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其DN模型的病理改變并不能很好地反應(yīng)人類(lèi)DN的疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程，因此建立更接近人類(lèi)DN疾病特征的非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)DN動(dòng)物模型并進(jìn)行深入研究，將有助于明確糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化過(guò)程是否存在EMT以及EMT的發(fā)生發(fā)

5、展機(jī)制。
　　目的:
　　通過(guò)建立穩(wěn)定的食蟹猴Ⅰ型糖尿病模型，研究糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的早期事件，并探討糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中腎小管上皮細(xì)胞是否發(fā)生EMT?
　　方法:
　　首先通過(guò)靜脈注射68mg/kg BW的鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ），誘導(dǎo)8只2.5-4歲的雄性青年食蟹猴成為Ⅰ型糖尿病模型，然后利用血糖監(jiān)測(cè)和靜脈糖耐量實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)模型的穩(wěn)定性及可靠性，待模型穩(wěn)定后根據(jù)最終糖尿病病程

6、分為糖尿病1年組(n=4)和糖尿病4年組(n=4)，同時(shí)選取4只年齡性別相同的正常食蟹猴作為正常對(duì)照組，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行以下相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究:1）分別對(duì)上述各組食蟹猴進(jìn)行常規(guī)空腹和餐后血糖的監(jiān)測(cè)，并對(duì)胰腺組織進(jìn)行胰島素抗體免疫熒光染色;2）分別對(duì)上述各組食蟹猴進(jìn)行血、尿生化指標(biāo)的檢測(cè);3）應(yīng)用H&E及Masson染色，分別檢測(cè)上述各組食蟹猴腎臟組織中腎小球和腎小管等組織結(jié)構(gòu)的病理變化以及腎間質(zhì)纖維化程度;4）通過(guò)投射電鏡觀察并結(jié)合體視學(xué)方

7、法定量分析腎小球基底膜厚度、Vv(mes/glom)、Vv(mes cell/glom)、Vv(mes matrix/glom)、Sv(PBGM/glom)、Sv(mes lumen/glom)、VV（間質(zhì)/皮質(zhì)）和PGBM％等超微結(jié)構(gòu)指標(biāo)在上述各組食蟹猴中的差異;5）通過(guò)免疫組化染色，檢測(cè)和比較EMT相關(guān)標(biāo)記物E-cadherin、α-SMA、FSP1以及關(guān)鍵誘導(dǎo)因子TGF-β1分別在上述各組食蟹猴腎組織中的分布及表達(dá)情況。
　

8、　結(jié)果:
　　1.血、尿生化檢驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病1年組食蟹猴與正常組食蟹猴比較，血清總膽固醇和血清甘油三酯明顯升高(P＜0.05)，而糖尿病4年組食蟹猴與正常組食蟹猴比較，僅血清總膽固醇明顯升高(P＜0.05)，其他血、尿生化檢驗(yàn)結(jié)果(如:血清尿素氮(BUN)、尿微量白蛋白與尿肌酐比值(ACR)和尿β2微球蛋白等腎損傷相關(guān)指標(biāo)）各組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.H&E及Masson染色結(jié)果顯示在糖尿病食蟹猴中隨

9、著糖尿病發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)可見(jiàn)明顯的腎小球體積增大、腎小管萎縮、腎小管管腔擴(kuò)張以及腎小管間質(zhì)纖維化等糖尿病腎病的病理改變。
　　3.電鏡及體視學(xué)定量分析結(jié)果顯示，糖尿病1年組食蟹猴與正常食蟹猴相比，未見(jiàn)明顯差異;糖尿病4年組食蟹猴與正常食蟹猴比較，腎小球基底膜明顯增厚，系膜區(qū)體積和腎小球周?chē)鶪BM表面密度顯著增大(P＜0.05)，但系膜細(xì)胞與腎小球的比值無(wú)明顯改變(P＞0.05)。
　　4.免疫組化結(jié)果顯示，與正常食蟹猴比較，在

10、糖尿病食蟹猴中，EMT發(fā)生的主要誘導(dǎo)因子TGF-β1在各組表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)，EMT主要標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)隨著糖尿病發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增高(P＜0.05)，F(xiàn)SP1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也隨糖尿病發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增多(P＜0.05)，而α-SMA表達(dá)量在各組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.單純STZ注射在食蟹猴僅能誘發(fā)早期糖尿病腎病的病理和生化指標(biāo)的改變。
　　2.在早期糖尿病腎病發(fā)病