纈沙坦防治糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化作用機制的研究.pdf

1、背景與目的：
　　 糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥,也是導(dǎo)致終末期腎臟病(end-stage renal disease,ESRD)的主要病因之一,腎間質(zhì)纖維化是ESRD的共同的病理學(xué)特點,因而盡早的延緩甚至逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化對防治DN進展有重要意義。纈沙坦作為一種血管緊張素受體拮抗劑,具有腎臟保護作用,其治療糖尿病腎病防治間質(zhì)纖維化的作用機制尚未完全明了。本研究以大鼠糖尿病

2、。腎病模型為研究對象,應(yīng)用纈沙坦進行干預(yù),分別檢測HIF-1α、TIMP-1、MMP-9在腎間質(zhì)中mRNA的表達變化,并結(jié)合尿蛋白定量及腎功能等其他生化指標(biāo),進而闡明DN間質(zhì)纖維化的發(fā)生機制,同時為臨床應(yīng)用ARB類藥物(纈沙坦)治療糖尿病腎病提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 健康雄性SPF級Sprague—Dawley(SD)大鼠54只,體質(zhì)量180～220 g,由河南省實驗動物中心提供。隨機分為正常對照組(C組,18

3、只)、糖尿病腎病模型組(D組,18只)和纈沙坦治療組(T組,18只)。動物禁食12小時,D組、T組大鼠采用鏈尿佐菌素(STZ)以60mg／kg一次性單側(cè)腹腔注射制備糖尿病腎病大鼠模型,C組動物注射等量的緩沖液。穩(wěn)定3天后尾靜脈采血測定血糖,將血糖大于16.7mmol／L為DM模型動物造模成功。普通飲食繼續(xù)喂養(yǎng)3周,用金屬代謝籠收集24小時尿液后,用磺基水楊酸法,并行空白對照測定24小時尿蛋白排泄量,當(dāng)24小時尿蛋白定量≥30mg時確認(rèn)D

4、N大鼠模型成功。造模后T組大鼠給予纈沙坦混懸液按40mg／kg·d一次性灌胃,C組和D組大鼠給予同等體積蒸餾水灌胃,分別于4周、8周、12周時測體重、血糖、血肌酐、血漿白蛋白；收集24小時尿標(biāo)本進行尿蛋白定量；腎臟稱重,計算腎臟指數(shù)(腎重／體重)腎組織進行石蠟切片、Masson染色、免疫組織化學(xué)法測定HIF-1α、TIMP-1、MMP-9在腎組織的表達變化,RT—PCR測定上述三因子的mRNA的表達變化。實驗期間自由飲水、進食,不使用胰

5、島素及其他降糖藥物。
　　 結(jié)果：
　　 1實驗室檢查
　　 DN大鼠造模成功后,D組T組大鼠的血糖即明顯高于C組(P<0.05),且在整個實驗過程中,血糖持續(xù)在高水平(見表1)。C組大鼠血糖、血漿白蛋白、24小時尿蛋白定量、腎臟指數(shù),血肌酐從4周到12周無明顯差別,D組大鼠血漿白蛋白、24小時尿蛋白定量、腎臟指數(shù)、血肌酐與同時間C組相比有顯著差異(P<0.05),在8周末、12周末T組大鼠24小時尿蛋白定量、腎

6、臟指數(shù),血肌酐顯著低于相應(yīng)D組,血漿白蛋白高于D組(P<0.05)(見表2—5)
　　 2.免疫組化
　　 正常對照組HIF-1α、TIMP-1在腎間質(zhì)及腎小管上皮細胞內(nèi)極少量表達,MMP-9表達呈陽性。D組及T組中HIF-1α,TIMP—1與MMP-9均表達于腎小管上皮細胞的胞漿中,8周與12周時,T組與D組相比較,TIMP—1與HIF-1α表達相對減少,MMP-9表達相對增多。
　　 3.Masson染色

7、r>　　 D組、T組大鼠腎間質(zhì)膠原相對面積(Masson染色腎間質(zhì)藍染區(qū)面積與視野面積的比值)明顯高于C組(P<0.05),從8周起T組腎間質(zhì)膠原相對面積低于D組(P<0.05)。(見表6,圖4.1-4.9)
　　 4.RT—PCR技術(shù)
　　 C組HIF-1α、TIMP-1、MMP-9mRNA表達在4周、8周、12周無明顯變化(p>0.05)。D組、T組HIF—1α、TIMP-1mRNA的表達明顯高于正常對照組(P<0

8、.05),并隨時間的變化逐漸增加,在8周、12周時T組的表達水平低于相應(yīng)D組(P<0.05)；D組、T組MMP-9mRNA的表達明顯低于C組(P<0.05),并隨時間的變化逐漸減少,在8周、12周時T組的MMP-9mRNA表達水平高于相應(yīng)D組(P<0.05)。(見圖A、1、2、3)
　　 5.相關(guān)性分析:糖尿病大鼠模型中HIF-1α,TIMP-1與腎間質(zhì)纖維化(RIF)面積及血肌酐成正相關(guān),MMP-9與腎間質(zhì)纖維化(RIF)面積