AngⅡ、ET-1及HIF-1α在糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化中的作用及干預(yù)研究.pdf

1、背景與目的:
　　 糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)發(fā)病率最高且危害最大的慢性微血管并發(fā)癥之一,現(xiàn)今國際范圍內(nèi)終未期。腎臟疾病(End stage renal disease,ESRD)的首要病因即為DN,約有40％的1型DM患者和5％-10％的2型DM患者會(huì)出現(xiàn)DN。DM可經(jīng)由各種不同途徑累及腎臟的所有解剖結(jié)構(gòu)(腎小球、腎小管、腎間質(zhì)和腎臟血管等)

2、。近期大量研究表明,在各種原發(fā)及繼發(fā)腎小球疾病中,腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis,RIF)程度是反映腎功能下降嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后最重要的指標(biāo)[1]。又有研究提示,RIF的程度與腎功能減退的相關(guān)性比。腎小球硬化與腎功能減退的相關(guān)性更為密切[2]。多種慢性腎臟疾病發(fā)展至ESRD均會(huì)經(jīng)過RIF這個(gè)共同的通路。兩種重要的血管活性激素血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)和內(nèi)皮素1(Endothe

3、lin-1,ET-1)均可由腎小管上皮細(xì)胞分泌,DN時(shí),隨著.AngⅡ及ET-1活性的增加,細(xì)胞增生、肥大,細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrixc,ECM)的降解受到抑制,同時(shí)ECM的合成增加,AngⅡ及ET-1還能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng),參與并加速RIF的進(jìn)程。慢性缺血、缺氧普遍存在于糖尿病腎病的RIF進(jìn)程中,缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是組織缺血、缺氧時(shí)表達(dá)增多的

4、標(biāo)志性產(chǎn)物；AngⅡ活性增加的同時(shí),可刺激HIF-1α在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)增高；HIF-1α亦是ET-1的上游基因,對(duì)其合成及分泌有調(diào)控作用,AngⅡ及ET-1間還存在交叉作用,AngⅡ能夠使內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶的活性增加,進(jìn)一步使前內(nèi)皮素原mRNA轉(zhuǎn)錄活性增加,最終使ET-1合成增多。ET-1能增加血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性,從而促進(jìn)血管緊張素Ⅰ向AngⅡ的轉(zhuǎn)化,另外一方面,二者效應(yīng)的發(fā)揮還可通過二者之間存在的共用受體實(shí)現(xiàn)[3]?？傊?AngⅡ

5、、ET-1及HIF-1α相互之間存在緊密聯(lián)系。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(Angiotensin receptor blockers,ARBs)在慢性腎臟病治療方面,有著不可忽視的作用,ARBs可明顯減少蛋白尿,且不依賴于血壓的控制,并能有效減少血壓正常的DM患者的尿蛋白排泄率[4],從而減少長期蛋白尿?qū)δI小球造成的損傷作用。近期隨著。腎小管間質(zhì)在DN發(fā)生發(fā)展中的作用日益得到重視,ARBs對(duì)腎小管間質(zhì)的保護(hù)作用也逐漸受到關(guān)注。ARBs對(duì)AT

6、I受體具有高度選擇性,能完全阻斷AngⅡ,從而對(duì)HIF-1α及ET-1二者之間也產(chǎn)生一定的阻斷作用,三者的生成減少,使腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展延緩,血管緊張素原(Angiotensinogen,AGT)為AngⅡ的前體,AngⅡ的生成受阻必然會(huì)反饋抑制AGT的合成。目前,有關(guān)AngⅡ、ET-1及HIF-1α在DN腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)情況及三者間的相互作用研究較少。
　　 故本研究擬從DN大鼠的模型和DN患者兩個(gè)層面,觀察糖尿病腎病

7、腎組織的RIF程度；并測定AngⅡ、ET-1及HIF-1α的表達(dá)水平,以及三者與腎臟損害程度的關(guān)系；并用纈沙坦干預(yù)治療,觀察纈沙坦對(duì)AngⅡ、ET-1及HIF—1α的影響。旨在從AngⅡ、ET-1及HIF-1α角度,探討糖尿病腎病RIF發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制,尋找預(yù)防和治療DN的新方法。
　　 方法:
　　 (一)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分
　　 選取雄性SD大鼠54只,隨機(jī)分成三組,即正常對(duì)照組(C組,n=18)、糖尿病模型組(

8、D組,n=18)和纈沙坦治療組(T組,n=18),禁食12小時(shí),D組、T組大鼠采用一次性單側(cè)腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)60mg／kg,以制備糖尿病大鼠模型,C組動(dòng)物注射相同體積的生理鹽水。穩(wěn)定72小時(shí)后,剪尾法采尾靜脈血測定血糖,若血糖大于16.7mmol／L,為DM模型動(dòng)物造模成功。普通飲食繼續(xù)喂養(yǎng)3周,用金屬代謝籠收集24小時(shí)尿液后,測定24小時(shí)尿總蛋白排泄量,當(dāng)24小時(shí)尿蛋白定量≥30mg時(shí),確認(rèn)D

9、N大鼠模型成功。造模后T組大鼠給予纈沙坦混懸液按40mg／kg／d一次性灌胃,C組和D組大鼠給予同等體積蒸餾水灌胃,分別于4周末、8周末及12周末時(shí)隨機(jī)選取6只大鼠,收集24小時(shí)尿液標(biāo)本進(jìn)行尿總蛋白定量；稱體重、腹主動(dòng)脈抽血測血糖、血肌酐、血漿白蛋白；腎臟稱重,腎組織進(jìn)行石蠟切片,Masson染色觀察腎小管間質(zhì)損害及纖維化；免疫組織化學(xué)法(即用型二步法)檢測AngⅡ、ET-1及HIF-1α在DN大鼠腎小管間質(zhì)中的表達(dá)；RT-PCR測定A

10、GT、ET-1及HIF-1αmRNA的表達(dá)。
　　 (二)臨床實(shí)驗(yàn)部分
　　 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科2008年1月至2010年6月經(jīng)臨床和病理確診的DN患者腎組織石蠟標(biāo)本共47例(男20例,女27例),年齡(29-70)歲；健康對(duì)照組6例(男3例,女3例),取自發(fā)生意外而切除的健康。腎組織。采用免疫組化檢測方法(即用型二步法),檢測AngⅡ、ET-1及HIF-1α在DN患者及健康對(duì)照組腎小管間質(zhì)中的表達(dá)。

11、　　 結(jié)果:
　　 1.D組及T組大鼠24小時(shí)尿蛋白總量、血肌酐、血清白蛋白、腎間質(zhì)纖維化面積等與同期C組相比,有顯著差異(P<0.05)；T組(纈沙坦治療組)上述病變相對(duì)D組有減輕。
　　 2.動(dòng)物免疫組化結(jié)果:C組中AngⅡ、ET-1及HIF-1α在腎間質(zhì)及腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)幾乎無表達(dá),D組及T組中三者的表達(dá)均有不同程度的增加,且隨著時(shí)間及病程的進(jìn)展,三者的表達(dá)逐漸增強(qiáng),T組與D組相比較,上述因子表達(dá)相對(duì)減少。

12、>　　 3.動(dòng)物RT-PCR結(jié)果:RT-PCR結(jié)果顯示,隨時(shí)間的推移,D組及T組AGT、ET-1及HIF-1αmRNA的表達(dá)逐漸增高,同期的T組較D組AGT、ET-1及HIF-1αmRNA的表達(dá)均有減弱,且8周及12周組間比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。
　　 4.DN患者臨床指標(biāo)與腎臟:(1)DN患者腎臟中存在RIF。(2)對(duì)照組腎臟中AngⅡ幾乎無表達(dá)、ET-1和HIF-1α有少量表達(dá),DN組中表達(dá)明顯增強(qiáng)。

13、(3)AngⅡ、ET-1及HIF-1α在DN患者腎小管間質(zhì)中的表達(dá)與RIF程度呈正相關(guān)。(4)AngⅡ、ET-1及HIF-1α的表達(dá)與DN患者血肌酐水平呈正相關(guān),與24小時(shí)尿蛋白定量、血糖及血漿白蛋白無相關(guān)性。
　　 結(jié)論:
　　 1.在DN大鼠模型及DN患者中,均存在不同程度的RIF,且AngⅡ、ET-1及HIF-1α在腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)中有不同程度的表達(dá)；三者的表達(dá)與腎功能減退水平均呈正相關(guān),提示AngⅡ、ET-1