HIF-1α在早期糖尿病腎臟纖維化易感性中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)作為糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，已經(jīng)成為導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的主要病因之一。據(jù)報(bào)道，在發(fā)達(dá)國(guó)家，糖尿病腎病是導(dǎo)致慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)的首要原因。而在我國(guó)，糖尿病腎病是僅次于慢性腎小球腎炎導(dǎo)致CKD的第二大因素。這主要由兩方面造成:一是糖尿病發(fā)病率日趨升高以及

2、發(fā)病年齡年輕化;二是人口老齡化。腎臟纖維化是DN的主要病理表現(xiàn)形式，可能的病理機(jī)制包括:(1)高血糖導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)紊亂和代謝紊亂;(2)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子的激活;(3)血管活性物質(zhì)代謝異常，比如一氧化氮合酶活性降低導(dǎo)致一氧化氮合成減少;(4)腎臟高濾過(guò)導(dǎo)致的氧耗增加以及細(xì)胞外基質(zhì)增多導(dǎo)致的氧氣彌散障礙。雖然目前臨床上有大量控制血壓、血糖、血脂及腎素-血管緊張素系統(tǒng)的相關(guān)藥物，但是仍舊不能延緩疾病進(jìn)展。其高致殘率和致

3、死率，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　有趣的是，有部分患者盡管血糖控制較好，仍無(wú)法避免進(jìn)展為ESRD。而有些患者即使血糖控制不佳，腎功能卻能維持在穩(wěn)定的水平。一方面與個(gè)體的異質(zhì)性有關(guān);另一方面可能與一些促纖維化始動(dòng)因素的存在有關(guān)。
　　本研究利用鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病和Akita自發(fā)性1型糖尿病鼠（6-8周齡）合并單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral

4、 obstruction,UUO)。研究結(jié)果證實(shí)，同樣是UUO手術(shù)，糖尿病組小鼠腎臟損傷程度明顯高于非糖尿病組，包括纖維化、細(xì)胞凋亡和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。體外實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)，高糖刺激下的小鼠腎小管上皮細(xì)胞在缺氧條件下fibronectin蛋白表達(dá)量高于其他各組。從這些現(xiàn)象可以看出，無(wú)論是體內(nèi)還是體外條件下，高糖組更易于發(fā)生纖維化。那么究竟是何種因素促使這種現(xiàn)象發(fā)生？其潛在的作用機(jī)制是什么？
　　為了闡述這個(gè)問(wèn)題，我們將目光聚焦于明星分子——

5、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxiainducible factors，HIFs)。腎臟血流大約占心輸出總量的20％，但是由于腎臟特殊的生理解剖結(jié)構(gòu)以及豐富的代謝活動(dòng)，導(dǎo)致腎臟極易出現(xiàn)缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子是機(jī)體組織為適應(yīng)缺氧而產(chǎn)生的一類(lèi)因子，主要包括HIF1、HIF2和HIF3，其中研究較多的為前兩種。HIF1和HIF2（統(tǒng)稱(chēng)為HIF）屬于PAS(per/aryl-hydrocarbon-receptor nuclear translocator

6、/Sim，PAS)家族，是含有堿性螺旋-環(huán)－螺旋結(jié)構(gòu)(basic helix-loop-helix，bHLH)的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。HIF是一種異原二聚體蛋白，包括α亞基β亞基。由于β亞基結(jié)構(gòu)與芳香羥受體核轉(zhuǎn)位蛋白（hydrocarbon-receptor nuclear translocator，ARNT）結(jié)構(gòu)相同，故又稱(chēng)為ARNT。正常情況下，HIFβ亞基在細(xì)胞漿中穩(wěn)定表達(dá)，HIFα在翻譯后即被泛素-蛋白酶體復(fù)合物降解。當(dāng)機(jī)體處于缺氧環(huán)境

7、時(shí)，HIFα無(wú)法經(jīng)泛素化途徑降解，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與HIFβ以及CBP/p300結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物，調(diào)控下游相關(guān)靶基因表達(dá)，比如調(diào)節(jié)血管生成、紅細(xì)胞生成、糖酵解、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡，調(diào)整氧氣的分布和提高機(jī)體對(duì)缺氧的耐受力。
　　腎臟包含有多種細(xì)胞類(lèi)型，并且在表達(dá)HIF方面存在差異。研究證實(shí)HIF1主要在腎小管和腎小球上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而HIF2主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)纖維化細(xì)胞中。有許多研究表明HIF在調(diào)控多種腎臟疾病具有重要作

8、用，比如缺血/再灌注相關(guān)急性腎損傷，5/6腎切除導(dǎo)致的慢性腎臟病等。對(duì)于HIF在調(diào)控糖尿病腎病纖維化方面所起的作用，目前仍存在諸多爭(zhēng)議。Nayak等學(xué)者證實(shí)糖尿病動(dòng)物模型引起的腎小球及間質(zhì)纖維化中有HIF表達(dá)，Rosenberger等學(xué)者同樣發(fā)現(xiàn)HIF1α不僅表達(dá)于糖尿病動(dòng)物模型，在糖尿病腎病患者的病理標(biāo)本中同樣有HIF1α的表達(dá)。本研究證實(shí)HIF1α在早期糖尿病纖維化中高表達(dá)，在一定程度上反映了HIF1α可能在調(diào)控早期糖尿病纖維化方面

9、起一定作用。
　　研究方法：
　　首先，利用STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠模型和C57BL/6J-Ins2Akita/+小鼠模型（由于6-8周齡年齡小鼠血糖升高僅有2-3周，可視為早期糖尿病模型），進(jìn)行UUO手術(shù)，通過(guò)馬松三色染色及四型骨膠原熒光染色觀察腎臟組織的骨膠原沉積，利用Western blot觀察纖維化指標(biāo)和HIF1α表達(dá)情況;利用巨噬細(xì)胞markerF4/80染色來(lái)評(píng)估腎臟組織內(nèi)的炎癥浸潤(rùn)情況;腎臟組織細(xì)胞的凋亡主要

10、依賴(lài)原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP mick-end labeling，TUNEL）。同時(shí)，運(yùn)用體外細(xì)胞模型--小鼠腎小管上皮細(xì)胞(the mouse PT cell，BUMPT-306 cell)，進(jìn)一步證實(shí)HIF1α在缺氧條件下高糖組的表達(dá)情況。明確HIF1α是否在糖尿病早期參與腎臟纖維化的形成。
　　其次，利用HIF1α的特異性抑制劑3-(5'-羥甲基-2'-呋喃基)-1-苯甲基吲唑{3-(5-hy

11、droxymethl-2-furyl)-1-benzylindazole，YC-1}干預(yù)細(xì)胞，通過(guò)Western blot觀察其對(duì)HIF1α和纖維化指標(biāo)表達(dá)的影響。另外利用HIF1α shRNA轉(zhuǎn)染大鼠腎小管上皮細(xì)胞(renal proximal tubular cell，RPTC)和人胚腎細(xì)胞(human embryonickidney，HEK)293，沉默HIF1α在上述細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)，進(jìn)一步觀察HIF1α和纖維化指標(biāo)的表達(dá)。

12、>　　最后，利用HIF抑制劑YC-1干預(yù)行UUO后的Akita糖尿病小鼠，觀察纖維化相關(guān)指標(biāo)及HIF1α的表達(dá)。為了深入研究HIF1α的作用，我們利用近端小管HIF1α特異性敲除(PT-HIF1α KO)小鼠和對(duì)照組(PT-HIF1αWT)小鼠，連續(xù)5天低劑量注射STZ誘導(dǎo)1型糖尿病模型，觀察發(fā)現(xiàn)PT-HIF1α KO小鼠較 PT-HIF1αWT小鼠而言，纖維化程度及腎損傷程度均較輕，進(jìn)一步證實(shí)HIF1α與早期糖尿病腎病纖維化敏感性的關(guān)

13、系。
　　研究結(jié)果：
　　(1) Akita小鼠和STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠分別行UUO手術(shù)后，腎臟組織內(nèi)骨膠原沉積呈時(shí)間依賴(lài)性上升，纖維化指標(biāo)fibronectin，α-SMA表達(dá)上升，同時(shí)伴隨HIF1α表達(dá)升高，且糖尿病組明顯高于同期對(duì)照組。此外，糖尿病組腎臟組織細(xì)胞凋亡程度明顯高于同期對(duì)照組，炎癥指標(biāo)F4/80結(jié)果顯示手術(shù)后炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，且糖尿病組高于對(duì)照組。
　　(2) HIF1α的特異性抑制劑YC-1

14、干預(yù)BUMPT細(xì)胞，HIF1α表達(dá)下調(diào)的RPTC和HEK293細(xì)胞系都顯示一致結(jié)果，fibronectin的表達(dá)降低，且降低程度與HIF1α表達(dá)抑制程度一致。
　　(3) YC-1干預(yù)UUO后的Akita糖尿病小鼠模型及PT-HIF1α KO和PT-HIF1αWT糖尿病小鼠模型顯示，抑制HIF1α不僅可以降低骨膠原沉積、細(xì)胞外基質(zhì)纖維化等指標(biāo)的表達(dá)，還可以減少腎臟組織細(xì)胞凋亡和間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　結(jié)論：
　　本課題