Sonic hedgehog信號通路在腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展中的表達(dá)變化及意義.pdf

1、腎小管間質(zhì)纖維化（Tubulointerstitial fibrosis，TIF）是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎病的共同通路，腎小管上皮細(xì)胞凋亡和表型轉(zhuǎn)化在TIF過程中發(fā)揮重要作用。過量服用含馬兜鈴酸（aristolochic acid，AA）中草藥引起的馬兜鈴酸腎病以腎間質(zhì)進(jìn)行性纖維化為特征，最終引起腎功能衰竭。單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteralobstruction，UUO)模型是目前應(yīng)用較為廣泛的研究腎小管間

2、質(zhì)進(jìn)行性纖維化的經(jīng)典動物模型。近年研究表明，Sonic hedgehog(Shh)信號通路在細(xì)胞增殖，促進(jìn)器官纖維化中起重要作用，但關(guān)于Shh與TIF的關(guān)系則未見報(bào)道。因此，我們通過AA作用腎小管上皮細(xì)胞和建立UUO模型來探討Shh通路在腎間質(zhì)纖維化過程中的活化情況。
　　 目的:
　　 1.利用不同濃度AA作用大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，觀察細(xì)胞表型活化及ECM情況，探討AA對腎小管上皮細(xì)胞的損傷作用及Shh信號

3、通路在腎小管上皮細(xì)胞損傷過程中的作用。
　　 2.通過建立UUO動物模型，探討Shh信號通路在腎間質(zhì)纖維化過程中的表達(dá)變化及可能的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.體外實(shí)驗(yàn):①培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E。實(shí)驗(yàn)分為對照組和AA組。對照組:不加AA; AA組:將1、10和100μg/mlAA加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中。②細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72h后，WST-1法檢測細(xì)胞增殖抑制率;Hoechst33258染色觀察

4、胞核形態(tài)變化;real-time RT-PCR檢測Ptch1、Smo、α-SMA、E-cadherin、TGF-β1和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá);Western Blot檢測bcl-2、bax、α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá);ELISA檢測腎組織中TGF-β1和Shh含量。
　　 2.UUO模型實(shí)驗(yàn):①選用48只SD大鼠隨機(jī)分為UUO組和假手術(shù)組，分別于術(shù)后第3、7、14天處死取其腎臟組織。②用HE、Masson染色觀察UU

5、O大鼠TIF程度。③實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測Shh信號和纖維化相關(guān)分子Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達(dá)。④免疫組織化學(xué)染色檢測Shh信號分子和Ⅲ型膠原的表達(dá)。⑤ELISA檢測腎組織中TGF-β1和Shh含量，并分析兩者相關(guān)性。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，評價(jià)Shh蛋白與TGF-β1含量的關(guān)系采用直線相關(guān)分析。以P＜0.05

6、為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外實(shí)驗(yàn):予不同濃度AA作用體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，AA明顯抑制NRK-52E細(xì)胞增殖，并呈濃度依賴性(r=0.817，P=0.047)。1和10μg/mlAA可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，100μg/ml AA則誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。AA以10μg/ml處理細(xì)胞24h后，bcl-2表達(dá)下調(diào)而bax升高，TGF-β1、α-SMA和Ⅲ型膠原表達(dá)增加，而E-cadherin表達(dá)下降

7、(P＜0.05)。Shh通路分子Shh、Smo、和Gli mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高;Ptch mRNA和蛋白表示水平明顯下降(P＜0.05)。
　　 2.UUO模型實(shí)驗(yàn):UUO組腎組織出現(xiàn)明顯的TIF，并且隨梗阻時(shí)間延長，TIF程度加劇。UUO腎組織TGF-β1、Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量較假手術(shù)組均明顯升高(P＜0.05)。同時(shí)，Shh通路分子Shh、Smo和Gli mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)，Ptch mRNA

8、和蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.01)，提示Shh信號通路被激活。相關(guān)分析表明，UUO腎組織Shh信號通路起始分子Shh表達(dá)水平與TGF-β1含量呈明顯相關(guān)性。
　　 結(jié)論:
　　 1.AA可明顯抑制細(xì)胞增殖，高濃度AA作用NRK-52E細(xì)胞所致的損傷表現(xiàn)為壞死，而低濃度AA作用則主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡，并證實(shí)可通過線粒體凋亡途徑發(fā)生凋亡。
　　 2.低濃度AA損傷腎小管上皮細(xì)胞，Shh信號通路被活化，可能誘導(dǎo)細(xì)胞表