腎上腺髓質(zhì)素在腎間質(zhì)纖維化中的意義及紅花對(duì)其表達(dá)的影響.pdf

1、腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎功能衰竭的共同病理特征。由于血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子等因素的作用，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡，大量積聚于腎臟是引起腎間質(zhì)纖維化的主要原因。腎間質(zhì)纖維化與腎小球的功能密切相關(guān)，故深入研究腎間質(zhì)纖維化的機(jī)理，對(duì)于慢性腎臟疾病的治療有著重要的意義。 腎上腺髓質(zhì)素是近年來新發(fā)現(xiàn)的血管活性肽，具有降低血壓、保護(hù)靶器官等作用，大量的試驗(yàn)研究還證實(shí)其可以拮抗血管緊張素Ⅱ，可以抑制細(xì)胞增殖，抑制轉(zhuǎn)

2、化生長因子的異常表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積等，而且是體內(nèi)自身分泌的物質(zhì)，在腎臟病的治療中有著很好的前景。 中醫(yī)藥在長期治療腎臟病的過程中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，尤其是活血藥物的使用，可以改善患者腎臟的血液循環(huán)，增加腎小球?yàn)V過率，抑制血管活性物質(zhì)和細(xì)胞因子的異常表達(dá)，加快細(xì)胞外基質(zhì)的降解，通過多途徑、多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)保護(hù)腎功能的作用，被廣泛的應(yīng)用于腎臟臨床。然而對(duì)腎小管損傷及間質(zhì)纖維化的干預(yù)治療研究尚存在很多不明之處，影響了臨床的廣泛使用

3、，有必要進(jìn)行深入研究。以往的研究結(jié)果是否與腎上腺髓質(zhì)素的表達(dá)有關(guān)，對(duì)其受體的作用如何是本課題的研究重點(diǎn)。 目的：本實(shí)驗(yàn)采用腎上腺髓質(zhì)素基因敲除小鼠和SD大鼠，結(jié)扎單側(cè)輸尿管，觀察在基因缺失狀態(tài)下腎臟形態(tài)損傷、轉(zhuǎn)化生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)與野生小鼠的不同之處。在此基礎(chǔ)上，觀察紅花對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化大鼠模型的作用，了解對(duì)腎上腺髓質(zhì)素及其受體表達(dá)的影響，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物梗阻側(cè)腎臟病理形態(tài)學(xué)以及轉(zhuǎn)化生長因子β1、Ⅲ型膠原的影響，探

4、討中藥紅花對(duì)腎間質(zhì)纖維化的拮抗作用及作用機(jī)理。 第一部分腎上腺髓質(zhì)素基因敲除小鼠間質(zhì)纖維化損傷的形態(tài)學(xué)改變 HE染色結(jié)果：野生小鼠假手術(shù)組小鼠腎臟組織切片表現(xiàn)未見異常，上皮細(xì)胞排列正常，無細(xì)胞水腫。模型組腎組織切片表現(xiàn)為因水腫造成腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)間隙增寬，近曲小管上皮細(xì)胞水腫、遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞缺失、壞死及細(xì)胞管型形成。在纈沙坦治療組腎臟損傷表現(xiàn)仍然嚴(yán)重，但優(yōu)于模型組。腎上腺髓質(zhì)素基因敲除小鼠假手術(shù)組腎臟病理切片未見異

5、常表現(xiàn)，與野生小鼠表現(xiàn)一致。模型組細(xì)胞損傷程度稍重于野生小鼠，細(xì)胞壞死程度明顯，小管擴(kuò)張嚴(yán)重。纈沙坦治療組優(yōu)于模型組但與野生小鼠比較無顯著性差別。 Masson染色結(jié)果：野生小鼠假手術(shù)組小鼠腎臟無異常；模型組小管擴(kuò)張，小管基底膜變薄，并出現(xiàn)了小管萎縮，間質(zhì)膠原成分明顯增多；纈沙坦治療組膠原成分增多但較模型組為輕。腎上腺髓質(zhì)素基因敲除小鼠假手術(shù)組與野生小鼠相同，無明顯異常改變，纖維成分未見增多。單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型組除小管擴(kuò)張和萎縮

6、外，膠原成分顯著增加，明顯多于野生小鼠。纈沙坦治療組較模型組有好轉(zhuǎn)但較野生小鼠損傷嚴(yán)重。 第二部分轉(zhuǎn)化生長因子β1在基因敲除小鼠腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物腎臟的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)、原位雜交和RT-PCR方法測定TGF-β1在野生小鼠及基因敲除小鼠中的異同。 1.TGF-β1蛋白表達(dá)結(jié)果假手術(shù)組TGF-β1免疫組化測定結(jié)果顯示野生小鼠腎小管上皮細(xì)胞及腎小球均呈弱陽性表達(dá)；腎上腺髓質(zhì)素基因敲除小鼠表達(dá)增強(qiáng)；野生小鼠單側(cè)輸

7、尿管結(jié)扎組TGF-β1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要在腎小管上皮細(xì)胞，部分間質(zhì)細(xì)胞亦有表達(dá)；基因敲除小鼠結(jié)扎單側(cè)輸尿管后，TGF-β1的表達(dá)較野生小鼠更為顯著，尤其是腎小管上皮細(xì)胞，亦可見到在間質(zhì)細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞的過度表達(dá)，呈片狀或條索狀。兩組小鼠經(jīng)纈沙坦治療后，均有不同程度的減弱。記分結(jié)果顯示，野生小鼠假手術(shù)組為0.73±0.09，UUO組為1.93±0.12，與假手術(shù)組相比有顯著性差異(p＜0.01)；治療組為1.40±0.09，與UUO

8、組相比有顯著性差異(p＜0.01)。腎上腺髓質(zhì)素基因敲除小鼠假手術(shù)組為1.2±0.09,與野生小鼠假手術(shù)組相比有顯著性差異(p＜0.01)；UUO組表達(dá)明顯增強(qiáng)，記分為2.50±0.12，無論與基因敲除小鼠假手術(shù)組還是野生小鼠UUO組相比，都有顯著性差異(p＜0.01)；治療組為1.48±0.09，與UUO組相比有顯著性差異(p＜0.01)，但與野生小鼠治療組相比無顯著性差別。 第三部分Ⅲ型膠原在腎上腺髓質(zhì)素基因敲除小鼠腎臟中的

9、表達(dá) Ⅲ型膠原免疫組化表達(dá)結(jié)果：野生小鼠和基因敲除小數(shù)假手術(shù)組腎臟中，僅有微量表達(dá)；結(jié)扎輸尿管后，Ⅲ型膠原的沉積明顯增多，基因敲除小鼠尤為明顯，治療組較模型組有所下降。Ⅲ型膠原主要沉積在小管間質(zhì)區(qū)，呈條索狀或塊狀樣沉積。采用評(píng)分法統(tǒng)計(jì)，野生小鼠假手術(shù)組、模型組、治療組分別為0.34±0.09，0.73±0.12和0.46±0.09，其中模型組與假手術(shù)組相比有顯著性差異(p＜0.001)；纈沙坦治療組與模型組相比有Ⅲ型膠原的沉積但

10、較輕，也有顯著性差異(p＜0.01)?；蚯贸∈蠹偈中g(shù)組、模型組及治療組的評(píng)分結(jié)果分別是0.43±0.08，0.95±0.16和0.55±0.12，其中模型組與假手術(shù)組相比有顯著性差異(p＜0.01)；纈沙坦治療組與模型組相比有Ⅲ型膠原的沉積但較輕，也有顯著性差異(p＜0.01)?；蚯贸∈蠹偈中g(shù)組與野生小鼠假手術(shù)組相比無顯著性差異，模型組相比有顯著性差異(p＜0.05)，治療組之間未見顯著性差異。RT-PCR測定結(jié)果顯示：Ⅲ型膠原

11、在野生小鼠及腎上腺髓質(zhì)素基因敲除小鼠假手術(shù)組呈弱表達(dá)，結(jié)扎單側(cè)輸尿管后表達(dá)明顯增強(qiáng)，其中基因敲除小鼠較野生小鼠有顯著性增強(qiáng)。給以纈沙坦治療后，其表達(dá)有不同程度的下調(diào)。 第四部分紅花對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎臟腎上腺髓質(zhì)素及其受體的影響 腎上腺髓質(zhì)素免疫組化測定結(jié)果：腎上腺髓質(zhì)素在假手術(shù)組表達(dá)較為廣泛，在皮質(zhì)及髓質(zhì)均有表達(dá)且以髓質(zhì)表達(dá)為明顯，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿，測定其陽性表達(dá)面積為3288±1912um，積分光密度為4

12、.65±1.44；UUO組腎上腺髓質(zhì)素的表達(dá)明顯減弱，在髓質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞無陽性表達(dá)，僅在皮質(zhì)部分區(qū)域有微弱表達(dá)，測定其陽性面積為1384±1053um，與假手術(shù)組相比有顯著性差異(p=0.002)；積分光密度為1.17±0.39，與假手術(shù)組相比有顯著性差異(p＜0.001)。紅花組腎上腺髓質(zhì)素的表達(dá)明顯增強(qiáng)，在皮質(zhì)及髓質(zhì)的腎小管上皮細(xì)胞胞漿廣泛表達(dá)，腎小球有微量表達(dá)，測定陽性表達(dá)面積為5431±1929um，積分光密度為5.34±1.

13、78，與UUO組相比均有顯著性差異(p＜0.001)；與假手術(shù)組相比雖有增高但無顯著性差異(p=0.181)。纈沙坦組陽性面積為2513.7±232.1，明顯高于UUO組，有顯著性差異(p＜0.01)，但明顯低于紅花組(p＜0.001)；積分光密度為4.17±0.23，與UUO組無顯著性差別但明顯低于紅花組(p＜0.05)。 第五部分紅花對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子β1及Ⅲ型膠原表達(dá)的影響 TGFβ1蛋白的測定結(jié)果：免疫組化測定結(jié)果顯

14、示，在假手術(shù)組大鼠腎臟，TGFβ1蛋白主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞及腎小球內(nèi)，亦可見于腎間質(zhì)細(xì)胞，呈弱陽性表達(dá)，陽性面積測定為1839.92±863.82um2,積分光密度為7.90±2.55；與假手術(shù)組比較，其余各組表達(dá)顯著增強(qiáng)，腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞均有強(qiáng)表達(dá)，腎小球內(nèi)的表達(dá)也明顯增強(qiáng)，其中，模型組與假手術(shù)組相比TGF-β1的陽性面積(20598.58±7115.06)及積分光密度值(59.66±16.01)均呈顯著性升高(P＜0.0

15、1)；紅花組TGF-β1的陽性面積(12942±4453.91)及積分光密度值(46.31±11.27)與模型組相比均顯著性下降(P＜0.05)；纈沙坦組與模型組相比，TGF-β1的陽性面積(11770.08±5035.51)及積分光密度值(45.02±13.13)亦明顯降低，有顯著性差別(P＜0.05)，提示紅花和纈沙坦均可抑制梗阻側(cè)腎組織中TGF-β1的蛋白表達(dá)；其中紅花組較纈沙坦表達(dá)稍強(qiáng)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無顯著性差異(P＞0.05)。

16、 結(jié)論：綜合以上結(jié)果進(jìn)行分析可得到以下結(jié)論： 1.腎上腺基因敲除小鼠結(jié)扎單側(cè)輸尿管所導(dǎo)致的間質(zhì)損傷較野生小鼠明顯。 2.梗阻性腎病腎組織中TGFβ1的表達(dá)明顯上升，腎上腺髓質(zhì)素基因敲除小鼠尤為明顯，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑可部分下調(diào)其表達(dá)。 3.腎上腺髓質(zhì)素可以抑制細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積，基因缺失小鼠與野生小鼠相比，腎間質(zhì)損傷后有顯著性不同。 4.紅花可以促進(jìn)腎上腺髓質(zhì)素及其受體在蛋白水平的表達(dá)。紅花