腎上腺髓質(zhì)素在黑素瘤中的表達和作用.pdf

1、惡性黑色素瘤是所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快的腫瘤之一,近年來受到廣泛重視,其臨床研究也進展迅速。黑素瘤的惡性程度高、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差,研究顯示腫瘤厚度>3mm的患者5年存活率不足60％,發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移后其平均生存期僅為6—9個月,5年生存率<5%。因此全面深入的研究黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展機制,尋找能夠有效預(yù)測其生物學(xué)行為的指標,對其早期診斷、指導(dǎo)治療和預(yù)后具有重要的意義。
　　腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,ADM)是

2、內(nèi)源性血管活性肽,是日本學(xué)者于1993年在嗜鉻細胞瘤組織中發(fā)現(xiàn)的。MillerMJ等觀察了肺、腸、乳腺、卵巢、前列腺、腦、軟骨、血液等組織來源的人腫瘤細胞系,發(fā)現(xiàn)超過90%的腫瘤高表達ADM,并指出ADM在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。ADM是否在黑素瘤也高表達及是否發(fā)揮了一定的生物學(xué)作用,需要研究證實。
　　第一部分:ADM在惡性黑素瘤中的表達
　　目的:
　　檢測ADM在人黑素瘤、色素痣組織及黑素瘤細胞系A(chǔ)37

3、5中的表達,以探討ADM在黑素瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　方法:
　　用免疫組化法檢測ADM在人黑素瘤、色素痣組織切片及A375中的表達情況。
　　結(jié)果:
　　惡性黑素瘤組織標本中80%檢測到ADM的表達,色素痣組織標本中僅有43.3%檢測到ADM的表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。人的成纖維細胞中ADM為弱陽性、A375中ADM呈強陽性。
　　結(jié)論:
　　腎上腺髓質(zhì)素在人惡性黑素瘤組織及細胞系

4、A375中高表達,在人的色素痣和成纖維細胞中低表達,提示ADM與惡性黑素瘤發(fā)生、發(fā)展可能密切相關(guān)。
　　第二部分:AMD在黑素瘤中的作用
　　目的:
　　探討siRNA沉默腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,ADM)基因后對黑素瘤細胞系A(chǔ)375增殖、凋亡、周期及侵襲力的影響。
　　方法:
　　1.實驗分組:采用人黑素瘤細胞株A375,利用人工合成的ADM靶向小分子干擾RNA(smallinterfe

5、renceRAN,siRNA)轉(zhuǎn)染A375細胞,以抑制ADM的表達,利用人工合成的非特異序列轉(zhuǎn)染A375細胞,作為陰性對照,同時以正常未轉(zhuǎn)染組細胞做為空白對照。
　　2.通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和免疫細胞化學(xué)法檢測處理后各組細胞ADM的表達情況,進而選擇最有效siRNA。
　　3.用最有效的siRNA轉(zhuǎn)染A375,分別于24、48h后用MTT法測各組細胞的增殖活性。
　　4.轉(zhuǎn)染48h后,用流式細胞儀檢

6、測各組細胞早期凋亡情況。
　　5.轉(zhuǎn)染48h后,流式細胞儀檢測各組細胞的周期情況。
　　6.轉(zhuǎn)染24h后,Transwell測定沉默ADM對A375體外侵襲力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.基因干擾后qRT-PCR篩選有效siRNA結(jié)果:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3干擾率分別為:15%,76%,50%。siRNA-2干擾效果最好。
　　2.轉(zhuǎn)染后免細胞化學(xué)法篩選有效siRNA結(jié)果:空白對照組

7、和轉(zhuǎn)染非特異序列組ADM的染色呈強陽性,陽性細胞數(shù)均在90%以上,兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3陽性細胞數(shù)分別為80%,35%,90%。siRAN-2組染色強度明顯弱于其他組。ADMsiRNA-2干擾效果最好。
　　3.基因干擾后細胞的增殖率:用ADMsiRAN-2轉(zhuǎn)染A37524、48h后各組OD值示:空白對照細胞和陰性對照細胞差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而轉(zhuǎn)染siRN

8、A的細胞與前兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。24、48h的抑制率分別為32.2%、31.5%。
　　4.沉默ADM后A375細胞的凋亡情況:轉(zhuǎn)染48h后用AnnexinV-EGFP/PI染色在流式細胞儀檢測,結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染siADM的細胞早期凋亡率(20.20±6.045)%;空白對照細胞組的早期凋亡率(1.67±0.340)%;陰性對照細胞的早期凋亡率(4.59±1.294)%,轉(zhuǎn)染siADM的細胞與空白對照和陰性對照

9、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而空白對照細胞和陰性對照細胞間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　5.沉默ADM后細胞DNA周期分布:轉(zhuǎn)染siRNA細胞的G2/M期細胞比率為(11.360±1.224)%;明顯高于空白對照(1.02±0.990)%和陰性對照組(4.150±1.032)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),空白對照與陰性對照差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而轉(zhuǎn)染siRNA細胞G1/G0、S期分別是(69.4

10、43±2.022)%、(19.197±0.890)%與空白對照(68.567±3.653)%、(30.417±4.588)%和陰性對照(70.530±3.008)%、(23.313±4.465)%,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　6.沉默ADM基因后A375體外侵襲力檢測結(jié)果:轉(zhuǎn)染siRNA細胞的穿膜數(shù)為43.750±3.772,明顯少于空白對照的70.500±2.723和陰性對照組的67.500±3.795,差異有統(tǒng)計

11、學(xué)意義(P<0.05);空白對照與陰性對照差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。MTT法顯示轉(zhuǎn)染siRNA細胞的穿膜細胞的OD值為0.185±0.055,低于空白對照的0.363±0.006和陰性對照的0.361±0.086,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),空白對照與陰性對照差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1沉默ADM基因可抑制A375細胞的生長；
　　2沉默ADM基因可促進A375細胞的凋亡；