重組腎上腺髓質(zhì)素真核表達(dá)載體的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin, ADM)是Kitamura等人于1993年從手術(shù)切除的人腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(phaeochromocytoma, PC)組織提取物中發(fā)現(xiàn)的一種生物活性肽.在體內(nèi),它廣泛分布于全身各系統(tǒng)中,具有舒張阻力血管,降低血壓,改善心臟收縮功能,利尿利鈉,增加腎臟血流灌注的作用.ADM被認(rèn)為是在臨床治療高血壓、慢性心功能衰竭等多種心血管疾病中具有巨大潛在應(yīng)用價(jià)值的一種內(nèi)源性多肽,因此,ADM基因也成為基因

2、治療慢性心功能不全的重要候選基因.同時(shí),也由于腎上腺髓質(zhì)素的臨床應(yīng)用受其半衰期短(僅22min)的限制,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,探索體內(nèi)表達(dá)ADM的方法,成為發(fā)揮ADM治療作用的一條有價(jià)值的途徑.該課題分為六部分.1.構(gòu)建重組ADM真核表達(dá)載體,并在無內(nèi)源性ADM表達(dá)的K<,562>細(xì)胞株上進(jìn)行了體外表達(dá)實(shí)驗(yàn).2.實(shí)驗(yàn)中用pcDNA3.1ADM處理體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞并用BCA方法檢測(cè)總蛋白含量,結(jié)果顯示,10<'-7>mol/L的AN

3、GⅡ處理心肌細(xì)胞72hr能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞總蛋白含量增加,而在開始用ANGⅡ處理細(xì)胞時(shí)即轉(zhuǎn)染pcDNA3.1ADM的一組72hr后ANGⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白合成增多得到部分抑制.3.實(shí)驗(yàn)中用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支的方法構(gòu)建了慢性心功能減退的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,并采用心動(dòng)超聲和導(dǎo)管法評(píng)價(jià)心臟功能.4.實(shí)驗(yàn)中用PCR方法檢測(cè)靜脈注射pcDNA3.1ADM后其在大鼠體內(nèi)的分布.結(jié)果在心、肺、腎、腦、肝、脾等臟器中擴(kuò)增到pcDNA3.1的部分特異序列.進(jìn)

4、一步用原位雜交的方法進(jìn)行檢測(cè).5.用放射免疫分析方法檢測(cè)大鼠血漿中ADM的含量,結(jié)扎冠狀動(dòng)脈5周后的大鼠,血漿ADM含量較假手術(shù)組血漿ADM含量有顯著增高.6.上述pcDNA3.1ADM載體表達(dá)的是腎上腺髓質(zhì)素前肽原翻譯區(qū).綜上所述,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中構(gòu)建了重組ADM真核表達(dá)載體pcDNA3.1ADM,并證實(shí)構(gòu)建的重組pcDNA3.1ADM載體能夠在哺乳類細(xì)胞中表達(dá)ADM.用pcDNA3.1ADM轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后,能抑制ANGⅡ誘導(dǎo)的蛋白合成增

5、多.在慢性心功能減退的大鼠中,靜脈給予100μg pcDNA3.1ADM后,CVP、LVEDP降低,EF、-dp/dt<,max>升高,尿排出量增加,顯示可以在不降低平均動(dòng)脈壓的情況下產(chǎn)生利尿作用,并顯示一定的改善心室舒張功能的作用.pcDNA3.1ADM在體內(nèi)多處廣泛分布,其中在肺臟、腎臟組織分布最為密集.給予外源性pcDNA3.1ADM后,血漿中和肺組織ADM含量有升高趨勢(shì),而心臟中ADM含量顯示下降趨勢(shì),可能是外源性表達(dá)增加和內(nèi)源