NK4基因重組真核表達載體的構建及在Raji細胞中的表達.pdf

1、目的: 克隆NK4基因，構建其重組真核表達載體，轉染Raji細胞，觀察NK4基因在Raji細胞的表達，為研究NK4的生物學效應和淋巴瘤的基因治療作相關基礎工作。 方法: 1.NK4基因的克隆與重組克隆載體的構建及鑒定 由新鮮人肝組織提取總RNA，行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)獲NK4基因cDNA，與載體pMD19-T Simple連接，構建重組克隆載體pMD19-T simple-NK4。將

2、重組克隆載體以CaCl2法轉化E.Coli DH5α并行氨芐青霉素和α-篩選，采用菌落直接PCR、MuⅠ和SalⅠ雙酶切及序列分析等方法，證實目的片段的存在和序列正確。 2.重組真核表達載體pVITRO2-mcs-NK4的構建與鑒定 將轉化重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的E.Coli DH5α增菌后，提取重組載體行MluⅠ和SaⅠ雙酶切，電泳膠回收目的片段并測定濃度，與經相同雙酶切的載體pVITRO

3、2-mcs提取物連接成重組表達載體pVITRO2-mcs-NK4。將重組表達載體轉化到E.Coli DH5α并行潮霉素B(100μg/ml)篩選，經菌落PCR、MluⅠ和SalⅠ雙酶切等方法確定目標片段的存在。 3.細胞培養(yǎng)條件及篩選用潮霉素B濃度的確定 在維持底層膠瓊脂糖濃度為0.5％的基礎上，對上層膠瓊脂糖濃度(0.1％～0.5％)和細胞濃度(100個/孔～5000個/孔)進行選擇，改良瓊脂糖半固體培養(yǎng)體系。取對

4、數生長期的Raji細胞，以終濃度為1×105個/ml分別接種于含10～200μg/ml潮霉素B的RPMI1640培養(yǎng)液(含10％新生牛血清)，于37℃、5％CO2靜置培養(yǎng)，以在10～14天致全部Raji細胞死亡的最低潮霉素B濃度作為篩選用濃度。 4.細胞轉染與陽性克隆的鑒定 采用脂質體轉染法行重組表達載體的轉染。37℃、5％CO2靜置培養(yǎng)24h后，用50μg/ml潮霉素B進行篩選。以僅加脂質體Raji細胞為空白對照，

5、載體pVITRO2-mcs轉染后Raji細胞為陰性對照。取篩選后存活組細胞提取總RNA，行RT-PCR，電泳，檢測NK4基因的存在以確定成功轉染。 5.NK4基因轉染后mRNA表達水平的檢測 取第1、7、15代NK4基因轉染后Raji細胞培養(yǎng)物提取總RNA，RT后采用實時熒光定量PCR，檢測NK4 mRNA的表達水平并評價其表達穩(wěn)定性，以未轉染Raji細胞和載體pVITRO2-mcs轉染組為對照。 6.NK

6、4基因轉染后蛋白表達的檢測 取處對數生長期的NK4基因轉染后Raji細胞，采用Western blot、細胞免疫化學法定性檢測NK4蛋白的表達。此外，分別收集第1、7、15代NK4基因轉染后Raji細胞培養(yǎng)物上清液，采用ELISA法定量檢測NK4蛋白的表達，并評價NK4蛋白表達的穩(wěn)定性。以未轉染Raji細胞組、載體pVITRO2-mcs轉染組作為對照。 7.NK4基因轉染對Raji細胞的生物學性狀的影響 取

7、NK4基因轉染Raji細胞分別做半固體克隆培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)和單層細胞培養(yǎng)，置37℃、50％CO2靜置培養(yǎng)。第3天起每天觀察細胞的生長情況至14天，觀察集落形成情況，分別評價NK4基因轉染對Raji細胞的增殖、侵襲和遷徙的影響。 結果: 1.NK4基因的克隆、重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的構建與鑒定 新鮮人肝組織提取總RNA后行RT-PCR，可見一約1.4 kb的特異性條帶，與目的片段大小一

8、致(1449 bp)，提示NK4 cDNA片段成功擴增。將pMD19-TSimple-NK4轉染E.Coli DH5α，篩選出陽性菌落。將陽性菌落PCR產物、重組克隆載體SalⅠ、MluⅠ雙酶切產物和未酶切重組載體等同時電泳，可見與目的片段大小一致的特異性條帶(1449 bp)，測序結果與Genebank報道的序列相同，提示pMD19-T Simple-NK4成功構建。 2.重組真核表達載體pVITRO2-mcs-NK4的構建

9、與鑒定 將重組表達載體pVITRO2-mcs-NK4轉染E.Coli DH5α后采用潮霉素B篩選出陽性菌落。將NK4基因的RT-PCR產物、陽性菌落PCR產物、重組表達載體SalⅠ和MiuⅠ雙酶切產物、未酶切重組載體等同時電泳，發(fā)現與目的片段大小一致的特異性條帶(1449 bp)，提示pVITRO2-mcs-NK4獲成功構建。 3.最佳細胞培養(yǎng)條件與篩選用潮霉素B濃度的確定 篩選后確定上層膠瓊脂糖濃度為0.

10、3％、細胞濃度為1000個/孔，0.5％底層瓊脂建立半固體培養(yǎng)體系。在常規(guī)靜置培養(yǎng)條件(含10％新生牛血清的RPMI1640，37℃、5％CO2)下，分別在10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml潮霉素B的作用下，10μg/ml、25μg/ml組細胞在10～14天后均有存活細胞，而其他4組均死亡，故以50μg/ml潮霉素B作為轉染后細胞的篩選濃度。 4.轉染后陽性細胞

11、的篩選與鑒定 經50μg/ml潮霉素B處理6天后各組細胞均出現大量細胞死亡。至14天空白對照組均死亡，陰性對照和實驗組仍存活，4周后存活細胞明顯增加。取常規(guī)培養(yǎng)Raji細胞、陰性對照和實驗組的細胞提取總RNA，行RT-PCR。擴增產物經電泳發(fā)現實驗組存在特異性條帶(1449 bp)，而常規(guī)培養(yǎng)Raji細胞、陰性對照均無，提示重組表達載體pVITRO2-mcs-NK4已成功轉染，且對照組均無NK4 mRNA表達。 5.

12、轉染后NK4基因表達的檢測 采用實時熒光定量PCR檢測第1、7、15代培養(yǎng)物NK4 mRNA的水平，結果發(fā)現：第1、7、15代pVITRO2-mcs-NK4轉染組培養(yǎng)物NK4 mRNA分別為6.68±0.32、6.37±0.29和6.53±0.24，但無顯著性差異(P>0.05)，而對照組呈極弱表達，提示NK4基因轉染后能在Raji細胞中能穩(wěn)定表達。 6.轉染后NK4蛋白表達的檢測 Western blo

13、t結果表明，NK4基因轉染后Raji細胞的培養(yǎng)液存在大小約50 kDa的蛋白條帶，而對照組均無；免疫細胞組化結果顯示，NK4基因轉染后Raji細胞的細胞漿呈藍色且有明顯的藍色顆粒，而未轉染Raji細胞組和載體pVITRO2-mcs轉染組均未藍染。ELISA檢測第1、7、15代NK4基因轉染后Raji細胞培養(yǎng)液上清中NK4蛋白量分別為4.14±0.19 ng/ml、4.32±0.27 ng/ml、4.37±0.38 ng/ml，提示各代培

14、養(yǎng)物均有NK4蛋白的表達，且無顯著性差異(P>0.05)，說明NK4基因轉染后能在Raji細胞中能穩(wěn)定表達NK4蛋白。 7.NK4基因轉染后對Raji細胞的生物學作用 細胞培養(yǎng)試驗表明，37℃、5％CO2半固體培養(yǎng)至14天發(fā)現：在常規(guī)克隆培養(yǎng)中，對照組形成的克隆邊緣不齊，有細胞向外生長，而NK4基因轉染細胞形成的克隆邊緣整齊，偶見向外生長的細胞；經穿刺培養(yǎng)發(fā)現各組均有條索狀細胞團形成，與對照組相比，實驗組細胞團較小，

15、邊緣較整齊，周圍散在性細胞少；而單層培養(yǎng)結果更為直觀，實驗組形成邊緣整齊的圓形細胞團，提示NK4基因轉染抑制了Raji細胞的增殖、遷徙和侵襲。 結論: NK4基因獲成功克隆并構建了重組真核表達載體pVITRO2-mcs-NK4。轉染NK4基因后的Raji細胞經RT-PCR發(fā)現存在特異性DNA片段。NK4基因在Raji細胞中可穩(wěn)定表達NK4 mRNA和蛋白，且可抑制Raji細胞的增殖、遷徙和侵襲。上述結果將有助于深入研