人重組RIZ1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在TE-13細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：
　　構(gòu)建人pcDNA3.1(+)/RIZ1真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染人食管鱗狀細(xì)胞癌TE-13細(xì)胞，觀察RIZ1在TE-13穩(wěn)定細(xì)胞株中的表達(dá)。
　　方法：
　　1.用RT-PCR方法從人食管癌組織中提取tRNA。
　　2.將從食管癌組織中提取的tRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
　　3.根據(jù)NCBI公布的RIZ1序列設(shè)計五對引物。
　　4.從食管癌組織的cDNA中對RIZ1各段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
　　5

2、.將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物連入T載體，并測序。
　　6.將測序正確的含PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒酶切后連入pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體。
　　7.將連入pcDNA3.1(+)的RIZ1基因進(jìn)行酶切鑒定并測序。
　　8.復(fù)蘇并培養(yǎng)人食管鱗狀細(xì)胞癌TE-13細(xì)胞。
　　9.提取pcDNA3.1(+)/RIZ1超純質(zhì)粒。
　　10.將pcDNA3.1(+)/RIZ1超純質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人食管鱗狀細(xì)胞癌TE-13細(xì)胞。
　　

3、11.Western-blotting鑒定pcDNA3.1(+)/RIZ1在人食管鱗狀細(xì)胞癌TE-13細(xì)胞中蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12g\L瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的基因條帶大小約5157bp，與理論預(yù)期值一致。構(gòu)建完成人重組RIZ1真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/RIZ1，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，與NCBI公布的RIZ1序列完全一致。
　　2.Western boltting檢測顯示，轉(zhuǎn)染