PTEN基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在MG63中表達(dá).pdf

1、目的：體外擴(kuò)增野生型PTEN基因,克隆至真核表達(dá)載體pEGFPN1,轉(zhuǎn)染至骨肉瘤MG63細(xì)胞系,并表達(dá)出PTEN蛋白。利用此真核表達(dá)載體,為進(jìn)一步探討PTEN基因在骨肉瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移中的價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：①pEGFPN1/PTEN真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定:收集、純化人淋巴細(xì)胞,在無菌、無RNA酶的條件下利用 Trizol試劑提取出淋巴細(xì)胞總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出PTEN基因片段,電泳分析結(jié)束

2、后回收純化 PCR產(chǎn)物,將PCR產(chǎn)物與空白質(zhì)粒pEGFPN1同時(shí)進(jìn)行雙酶切,兩種酶切產(chǎn)物經(jīng)高保真T4 DNA連接酶作用后,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌TOP10,LB瓊脂平板中培養(yǎng)過夜。經(jīng) PCR初篩,陽性克隆通過PCR、雙酶切和測(cè)序的方式對(duì)重組載體進(jìn)行鑒定,測(cè)序結(jié)果使用BLAST軟件與 GeneBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析。②MG63細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和重組人PTEN蛋白的表達(dá)及檢測(cè):取純化除菌的重組質(zhì)粒pEGFPN1/PTEN,在轉(zhuǎn)染試劑Lipof

3、ecta mineTM2000的作用下轉(zhuǎn)染至MG63細(xì)胞。通過倒置熒光顯微鏡觀察GFP綠色熒光蛋白的表達(dá)情況了解轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞,RT-PCR和Western blot鑒定PTEN mRNA和蛋白在MG63細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：①反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增成功獲得一具有1209bp完整開放讀碼框的PTEN的cDNA片段。成功地將其克隆入真核表達(dá)載體pEGFPN1;將構(gòu)建載體pEGFPN1/PTEN

4、做EcoRI、BamH I雙酶切和PCR,分別獲得了一個(gè)大小與其相應(yīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一致的插入片段;經(jīng)測(cè)序及 Blast分析鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。②脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞24小時(shí)后可見綠色熒光蛋白的表達(dá),48小時(shí)后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞,RT-PCR和Western blot鑒定重組PTEN真核表達(dá)載體在MG63細(xì)胞中能表達(dá)出PTEN mRNA和蛋白,電泳圖上可見于PTEN大小相一致的條帶,Western結(jié)果在54kD處可見陽性條帶。