SLC基因真核表達載體的構(gòu)建及在COS-7細胞中的表達.pdf

1、目的次級淋巴組織趨化因子(secondarylymphoidtissuechemokine，SLC)又稱為CCL21(CCchemokineligand21)、6Ckine、exodous2、TCA4等，是趨化因子家族CC亞族中的成員，對多種免疫細胞具有趨化作用。研究表明，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用的免疫細胞，包括T細胞、B細胞、DC和NK細胞，膜表面均表達SLC的受體CCR7。SLC通過與CCR7結(jié)合，募集免疫細胞向腫瘤局部遷移、

2、浸潤，刺激它們產(chǎn)生IFN-γ、GM-CSF、IL-12等細胞因子，增強非特異性免疫，抑制腫瘤血管生成，因而具有顯著的抗腫瘤作用，是目前腫瘤免疫治療的理想效應(yīng)分子。研究證實，重組蛋白SLC瘤內(nèi)注射能產(chǎn)生較強的抗腫瘤免疫效應(yīng)，并抑制腫瘤的生長。然而，SLC蛋白注射療法不可避免的具有反復(fù)、多次、大劑量注射所帶來的副作用，且效果不持久。 為了深入研究SLC對免疫細胞的趨化活性、促增殖作用及在抗腫瘤作用中的地位，探索SLC基因免疫治療腫瘤

3、的有效途徑，本實驗擬構(gòu)建含小鼠SLC全長cDNA序列的真核表達載體，通過電穿孔法，以其轉(zhuǎn)染COS-7細胞，研究小鼠SLC在體外的瞬時表達，為進一步利用小鼠SLC基因免疫治療腫瘤的實驗研究奠定基礎(chǔ)。但是，用單獨的SLC基因治療時，存在局部濃度低、作用時間短的缺點，抗腫瘤的作用也有限：若與其它基因聯(lián)合應(yīng)用時，SLC基因可表現(xiàn)出較強的抗腫瘤效應(yīng)。因此，可選擇與SLC基因具有協(xié)同或/和互補免疫調(diào)節(jié)作用或/和抗腫瘤作用的細胞因子基因及協(xié)同刺激分子

4、基因，聯(lián)合進行基因治療。 IL-2能作用于T細胞、B細胞、DC及NK細胞等，促進細胞增殖并誘導(dǎo)細胞分泌IFNα、IL-4、TNF和CSF等細胞因子，同時還可增強CTL的細胞毒活性、激活NK、LAK細胞的直接殺傷作用等，有效地擴增針對腫瘤抗原的B細胞及T細胞應(yīng)答，常用于惡性腫瘤的免疫治療。SLC和IL-2在激發(fā)機體特異和非特異抗腫瘤免疫應(yīng)答方面均具有重要功能，可分別作用于抗原提呈細胞和免疫效應(yīng)細胞，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。 本

5、實驗中，我們擬通過PCR的方法克隆hSLC基因片段，然后將其插入到真核表達載體pIRES的多克隆酶切位點中，使hSLC基因置于能在真核細胞中高效表達的CMV啟動予調(diào)控之下，構(gòu)建重組真核表達載體pSLC-IRES。我們以具有雙基因共表達特性的IRES相連處于同一啟動子控制下的hSLC和hIL-2，構(gòu)建高效表達SLC和IL-2的共表達質(zhì)粒pSLC-IRES-IL-2，并探討表達的SLC和IL-2在抗腫瘤基因治療中的協(xié)同效應(yīng)，為進一步運用該共

6、表達質(zhì)粒對腫瘤進行基因治療的實驗研究提供依據(jù)。 研究內(nèi)容及方法 1.重組共表達載體pSLC-IRES-IL-2的構(gòu)建及在COS-7細胞中的表達 (1).用PCR擴增SLC基因。 (2).以亞克隆技術(shù)構(gòu)建重組載體pSLC-IRES，并酶切鑒定。 (3).采用異硫氰酸胍一步法提取Jurkat細胞的總RNA。以提取的總RNA為模板，RT-PCR擴增IL-2基因。 (4).采用TA克隆技術(shù)構(gòu)建克隆

7、載體pMD-hIL-2，酶切鑒定并測序。 (5).利用亞克隆技術(shù)，構(gòu)建共表達質(zhì)粒pSLC-IRES-IL-2，酶切鑒定。 (6).采用電穿孔法，以共表達質(zhì)粒pSLC-IRES-IL-2轉(zhuǎn)染COS-7細胞。 (7).Westernblot檢測重組蛋白表達 。2.小鼠SLC真核表達載體pVAX1-mSLC的構(gòu)建及瞬時表達。 (1).利用亞克隆技術(shù)，構(gòu)建重組載體pVAX1-mSLC，并酶切鑒定。

8、 (2).采用體外電穿孔法轉(zhuǎn)染COS-7細胞。 (3).Westernblot檢測重組蛋白表達。 結(jié)果 1.重組共表達載體pSLC-IRES-IL-2的構(gòu)建及在COS-7細胞中的表達 (1).以質(zhì)粒pSK-hSLC為模板進行PCR擴增，得到大小為420bp的hSLC基因片段，與預(yù)期的結(jié)果相一致。以XhoⅠ和EcoRⅠ酶切hSLC基因片段和載體pIRES后，進行連接，菌落PCR篩選及XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶

9、切鑒定證實pSLC-IRES構(gòu)建成功。 (2).從人Jurkat細胞的總RNA中，用RT-PCR擴增的含信號肽的hIL-2基因片段大小為510bp，與預(yù)期的結(jié)果相一致。 (3).取hIL-2基因的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α菌株。菌落PCR擴增產(chǎn)物約為510bp。XbalⅠ酶切重組質(zhì)粒后，得到250bp和2950bp大小的片段，表明目的基因片段已經(jīng)插入pMD18-T中。提取質(zhì)粒pMD-hIL

10、-2進行測序，所測DNA的序列與GenBank中人IL-2cDNA的序列一致，表明擴增的為人IL-2基因。 (4).取pSLC-IRES質(zhì)粒與經(jīng)同樣雙酶切質(zhì)粒pMD-hIL-2后獲得的hIL-2基因片段相連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α菌株。菌落PCR篩選及NotⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定證實，共表達質(zhì)粒pIRES-hSLC-hIL-2構(gòu)建成功。 (5).采用電穿孔法，以共表達質(zhì)粒pSLC-IRES-IL-2轉(zhuǎn)染COS-7細胞。We

11、sternblot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的COS-7細胞能分泌性表達SLC和IL-2蛋白。 2.小鼠SLC真核表達載體pVAX1-mSLC的構(gòu)建及瞬時表達 (1).用BamHⅠ和XbaⅠ分別雙酶切克隆質(zhì)粒pMD-mSLC和pVAX1載體，回收410bp大小的mSLC片段及線性化pVAX1載體，進行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10菌株。菌落PCR篩選及HinDⅢ酶切鑒定證實，表達質(zhì)粒pVAX1-mSLC構(gòu)建成功。 (2).

12、采用電穿孔法，以表達質(zhì)粒pVAX1-mSLC轉(zhuǎn)染COS-7細胞。Westernblot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的COS-7細胞能表達mSLC。 結(jié)論 1.成功地構(gòu)建hSLC和hIL-2基因的共表達質(zhì)粒，以其轉(zhuǎn)染COS-7細胞后，能分泌性表達SLC和IL-2，為探討SLC和IL-2在抗腫瘤基因治療中的協(xié)同效應(yīng)提供實驗依據(jù)。 2.成功地構(gòu)建小鼠SLC基因的真核表達質(zhì)粒pVAX1-mSLC，以其轉(zhuǎn)染COS-7細胞后，能瞬時